姜黄联合山楂对C57 肥胖小鼠的减肥作用及机制研究

李 强，李亚婷，徐华健，郝宗围，陈鹏浩，司雄元，汪雪雁,

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036；2.安徽农业大学生物技术中心，安徽合肥 230036）

肥胖是一种复杂的慢性疾病。研究表明，目前我国城乡居民超重或肥胖人数已超过总人口一半，慢性病发病率显著上升[1]。显然膳食结构是引起肥胖和慢性病因素之一[2]。目前关于肥胖的定义有两种：一种是世界卫生组织所提倡的采用BMI 指数进行分类以定义肥胖等级[3]，另一种是通过机器检测人体体脂率表明人体的肥胖程度[4]。研究表明，肥胖不仅通过影响人们的心理健康导致死亡率上升，也会引起人体疾病产生严重危害[5]，如：非酒精性脂肪肝[6]、血脂异常、2 型糖尿病[7]、高血压[8]、生殖障碍[9]，甚至引发相关器官组织的癌症病变[10]。当前可通过调节以下机制来治疗肥胖：调节体内神经肽Y 的激素水平可调节食欲，维持机体能量平衡[11]；抑制糖类、脂类相关酶的活性。通过抑制脂肪酶、糖苷酶以及淀粉酶的活性减少胃肠道对食物的吸收，进而降低机体内的能量摄入[12]；抑制前脂肪细胞分化和增殖。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）在脂肪代谢过程中具有关键的调节作用，在调节前脂肪细胞的分化和增殖有重大作用，在此过程中还与CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）共同调控[13]。

复方在中药的应用调节上有整体观念，其化学组成的多成分特性，药理作用的多靶点功效，相比单一的天然提取物或单一靶点的西药具有更明显的优势[14]。研究发现，姜黄（Curcuma longaL.）与山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）联用可能具有协同增效的作用[15]，但还未得到更进一步的证实以及机理方面的探讨。姜黄含有姜黄素、倍半萜、二萜、三萜、甾醇、生物碱等功能性成分[16]。姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素在抗氧化、抗炎和抗增殖作用有着不同的优势[17]。因此姜黄的抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、止痛等作用也就更为明确[18-19]。姜黄素的生物利用率比较低。有研究显示，姜黄中的姜黄油可以提高姜黄素的生物利用度[20]。山楂为蔷薇科植物的干燥成熟果实，消食健胃、行气散瘀、化浊降脂。山楂含有丰富的类黄酮及其衍生物、多糖、有机酸类化合物、萜类化合物[21]。山楂由于在心血管治疗、抗氧化、抗菌等方面作用突出，成为了植物治疗和食品应用中非常受欢迎的草药[22]。

综上所述，虽然已有姜黄、山楂在降血脂、2 型糖尿病以及抗氧化方面的研究，但针对二者联合在治疗肥胖及机制上的研究还未见报道。山楂和姜黄同属药食同源类产品，其安全性能够保障。同时人们也倾向于天然、可持续的植物活性成分的药物，而此类药物多数兼具安全性、疗效性、高利用度和低成本等优势[23]。本文以姜黄和山楂为研究对象，探究姜黄和山楂对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的减肥作用及可能机制，为后续药食同源产品的联用，以及姜黄-山楂产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C57BL/6JNifdc 小鼠，SPF 级、雄性、5～6 周、32 只 由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001，动物合格证编号：No.20220316Abzz0600 000749；60%高脂饲料（TP23300）南通特洛菲饲料科技有限公司；维持饲料 江苏省协同医药生物工程有限责任公司；姜黄、山楂 北京同仁堂；多聚甲醛固定液 上海碧云天生物技术有限公司；脂肪固定液 上海源叶生物科技有限公司；二甲苯、中性树胶 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（色谱纯）、HE 染液、分化液、返蓝液 Servicebio；总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT/GOT）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST/GOT）试剂盒 南京建成生物工程研究所；DNA 提取试剂盒、反转录试剂盒 赛默飞。

Allegra 64R 高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；Multiskan FC 酶标仪 美国BIOTEK 公司；LF50 小动物组分分析仪 德国布鲁克公司；JJ-12J 脱水机 武汉俊杰电子有限公司；JB-P5包埋机 武汉俊杰电子有限公司；RM2255 切片机上海徕卡仪器有限公司组织；KD-Pll 摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；Ni-E 正置光学显微镜 日本尼康；ECLIPSE-Ti2 成像系统 日本尼康；GHC50023 电子秤 泊名臻品；580 血糖仪 鱼跃；VeritiPro PCR 仪 赛默飞。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验与分组处理 32 只雄性SPF 级C57BL/6J 小鼠（体质量18～22 g）饲养条件：动物房湿度40%～70%，温度（23±3）℃，压差10～30 Pa，光照黑暗各12 h，饲养于安徽省合肥市安徽农业大学国家重点实验室SPF 级动物房，自由摄取食物和饮水。适应性饲喂1 周，随机分为正常组、正常干预组、高脂组、高脂干预组，每组8 只。正常组饲喂基础饲料，高脂组饲喂高脂饲料。姜黄和山楂粉碎过60 目筛，制成粉末，纯水灌胃，各干预组按照姜黄、山楂各390 mg/kg 混合灌胃（剂量参照中国药典，灌胃溶液参照丸剂剂量），连续灌胃12 周，处死前禁食12 h，采用4%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，颈椎脱臼处死，血液经2000 r/min 离心10 min，取上清备用。附睾脂肪保存于脂肪固定液。肝脏分别保存于多聚甲醛固定液、RNAlater 保存液、-80 ℃环境中。本研究动物实验获得安徽农业大学动物伦理委员会批准，伦理编号AHAU2022019。

1.2.2 小鼠体重检测 从小鼠适应一周开始，每周同一时间称量体重。

1.2.3 小鼠摄食饮水量的测定 每周同一时间更换小鼠垫料，同时统计小鼠饮水、摄食量。

1.2.4 小鼠体质成分的测定 将机器进行日常开机检验，用酒精将检测筒擦拭干净，同时在检测过程中及时清理小鼠产生的异物，避免沾染其它小鼠的气味对实验造成影响。每周同一时间测定小鼠体质成分。

1.2.5 小鼠随机血糖的测定 每隔两周在同一时间测定小鼠的随机血糖，采用尾尖取血，弃去第一滴血。

1.2.6 小鼠血清生化指标检测 以试剂盒测定小鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT 含量，测定方法严格按照说明书操作。

1.2.7 肝组织病理学检查 参照温永平等[24]的方法并稍作修改，取小鼠同部位的肝脏组织一小块，置于4%多聚甲醛固定液，固定48 h 以后，脱水浸蜡、包埋和切片后制成厚度为4 μm 的石蜡切片，经苏木素-伊红染色后，脱水封片，放置显微镜镜检，采集图像进行分析，过程中注意细胞核分化以及苏木素、伊红效价。

1.2.8 脂肪组织病理学检查 取同一部位小鼠附睾脂肪，置于脂肪固定液中固定48 h 后，参照1.2.7 肝脏组织病理学检查进行操作。

1.2.9 实时荧光定量PCR 法测定肝脏中脂质代谢通路中mRNA 相对表达量 参考沈海亮[25]的方法并稍作修改，提取各组小鼠肝组织的总RNA，测定其浓度和纯度，稀释浓度过高的RNA 使其最终浓度为100～500 ng/μL，随即使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。采用qPCR 法测定胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）、肝X 受体α（Liver X Receptorα，LXRα）、固醇调节元件结合蛋白2（Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBP2）、固醇调节元件结合蛋白1C（Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBP1C）、硬脂酰辅酶A 去饱和酶（Steary-coenzyme A dehydro-synthase-1，SCD1）的mRNA 相对表达量。反应体系：在0.2 mL 的PCR 管内加入，2×qPCR Mix（7.5 μL），2.5 μmol/L 上下游基因引物（1.5 μL），cDNA（2.0 μL），添Water Nuclease-Free（4.0 μL）。反应条件：95 ℃预变性30 s，40 个循环（95 ℃变性15 s，60 ℃延伸 30 s），溶解曲线选择在65～95 ℃，每升温0.5 ℃，采集一次荧光信号。选择GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列如表1 所示。

表1 荧光qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescence qPCR

1.3 数据处理

采用SPSS 26.0 软件统计处理，各组数据以均数±标准差（Mean±SEM）表示，采用单因素ANOVA分析，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 姜黄联合山楂对小鼠体重的影响

研究表明高脂饮食可以增加机体体质量[26]，相比正常小鼠，体重超过20%可定义为肥胖[27]。由图1可知，在12 周的实验期间，各组小鼠体质量均呈现增长趋势，增长差异较大。随着时间的增加，高脂组与正常组相比，体重显著升高（P＜0.05），当实验到达第六周时，相比高脂组，高脂干预组显著降低直至实验结束（P＜0.05）。而在整个实验期间，相比正常组，正常干预组的体重没有显著差异，说明姜黄-山楂联合干预对正常组小鼠体重没有影响。在第12 周结束时，正常组小鼠平均体质量达到28.56 g，相比正常组，高脂组平均体质量增加46.88%，差异高度显著（P＜0.001）。相比高脂组，高脂干预组平均体质量下降13.4%，差异极显著（P＜0.01），说明姜黄-山楂联用可以有效减缓小鼠体质量的增加。图中可以看到，在最初的两周干预组平均体重上升比非干预组快，这可能是由于山楂的健胃消食作用。

图1 姜黄-山楂联用对小鼠体质量的影响Fig.1 Effect of turmeric-hawthorn combination on body mass of mice

2.2 姜黄联合山楂对小鼠摄食、饮水的影响

如图2a、2b 所示，总体而言，相比正常组，正常干预组的摄食、饮水量差异不大。相比高脂组，高脂干预组的摄食、饮水量差异不大。说明姜黄-山楂联用，对小鼠的饮水、摄食量无影响。高脂组和高脂干预组摄食量和饮水量低于正常组和正常干预组。这可能是由于饮食结构的不同，维持饲料提供的能量远低于高脂饲料，这可能是导致高脂组摄食量减少的原因，此结果与夏海梅等[28]的研究一致。

图2 姜黄-山楂联用对小鼠摄食、饮水的影响Fig.2 Effect of turmeric-hawthorn combination on feeding and drinking in mice

2.3 姜黄联合山楂对小鼠体质成分的影响

本实验将监测小鼠体质成分所得数据分为脂肪率（总脂肪含量/体重）和瘦肉率（总瘦肉含量/体重），目前，越来越多的人认为，脂肪含量和肥胖息息相关[29]。图3a 为监测所得各阶段小鼠脂肪率，正常干预组长期稳定在7%左右的脂肪率，正常组长期稳定在10%左右，实验结束最后一周差异不显著（P＞0.05）。与正常组相比，实验第一周，高脂组脂肪率差异高度显著（P＜0.001），随时间增加，高脂组脂肪率由10%上升至28%。相比于高脂组，高脂干预组脂肪率上升缓慢，由实验开始时10%上升至22%，差异显著（P＜0.05），说明姜黄联合山楂能够抑制小鼠脂肪率的增加。研究表明，瘦肉率能够间接反映机体肥胖程度[30]。图3b 为监测所得小鼠瘦肉率。正常干预组长期稳定在70%左右的瘦肉率，正常组长期稳定在68%左右，实验结束时差异不显著（P＞0.05）。实验第一周，正常干预组与正常组具有显著差异（P＜0.05），说明姜黄-山楂联用能够调高小鼠体内瘦肉率的含量。与正常组相比，高脂组瘦肉率由开始时的70%下降至54%，实验结束时差异极显著（P＜0.01）。相比高脂组，高脂干预组瘦肉率由70%下降至60%，实验结束时差异显著（P＜0.05），说明姜黄-山楂联用，能够有效地减缓小鼠体内瘦肉含量的下降，因此，摄入姜黄和山楂能够减少小鼠体内脂肪含量，增加小鼠体内瘦肉的含量，从而起到预防肥胖的作用。

图3 姜黄-山楂联用对小鼠体质成分的影响Fig.3 Effect of turmeric-hawthorn combination on the body composition of mice

2.4 姜黄联合山楂对小鼠随机血糖的影响

研究表明，肥胖人群通常随机血糖也普遍较高[31]。实验为尽可能地保证小鼠生长周期减少外在环境的影响，进行了对小鼠12 周的随机血糖监测。如图4所示，除干预组外，各组小鼠血糖值相对稳定。高脂组血糖值最高，但都未达到11.1 mmol/L（高血糖标准）。相比正常组，高脂组小鼠血糖含量差异极显著（P＜0.01）。除试验期间第四周外，相比高脂组，高脂干预组血糖极显著下降（P＜0.01），有时甚至低于正常组，说明姜黄-山楂联用在控制小鼠随机血糖的水平上，具有较好的效果。这与LIU 等[32]、ADAB 等[33]的研究一致。

图4 姜黄-山楂联用对小鼠随机血糖的影响Fig.4 Effect of turmeric-hawthorn combination on random blood glucose in mice

2.5 姜黄联合山楂对小鼠血清生化指标的影响

如图5 a～d 所示，与正常组相比，高脂组血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平差异高度显著（P＜0.001）。相比高脂组，高脂干预组能够高度显著降低高脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平（P＜0.001），高度显著升高HDL-C 水平（P＜0.001），这可能是姜黄-山楂参与了小鼠的脂代谢，降低了血清中TC、TG、LDL-C 含量，升高了HDL-C 含量。说明姜黄-山楂联用具有较好的降脂效果。图5e、5f 所示，与正常组相比，高脂组能够高度显著升高小鼠血清中AST、ALT 的含量（P＜0.001）。相比高脂组，高脂干预组能够显著降低小鼠血清中AST、ALT 含量（P＜0.001）。这与TAN 等[34]的研究结果一致。说明姜黄-山楂联用能够降低小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白胆固醇水平，升高血清中的高密度脂蛋白胆固醇水平，并且能够保护高脂饮食对肝脏带来的损伤。可能是姜黄中含有的姜黄素、姜黄油，以及山楂中的黄酮类等成分对机体产生的抗炎、降脂等作用[35-37]，从而达到了预防肥胖的目的。

图5 姜黄-山楂联用对小鼠血清生化指标的影响Fig.5 Effect of turmeric-hawthorn combination on serum biochemical indexes of mice

2.6 肝脏病理学分析

如图6 所示，各组小鼠肝脏组织经HE 染色，可以看出正常组小鼠肝小叶结构紧密、分界清晰，组织结构无异常，细胞内未见明显脂滴，肝窦未见挤压或扩张。正常干预组肝细胞排列有序，未发现明显异常，表明姜黄-山楂无肝毒性。与正常组相比，高脂组细胞排列混乱，边界不清晰，肝质疏松。大量干细胞呈球状样变，间隙内含有较多脂肪空泡，核仁偏移。肝细胞坏死，炎性细胞浸润、血管周围肝细胞肿胀明显。与高脂组相比，高脂干预组边界模糊、脂肪空泡、核仁偏移改善明显，血管周围的脂质松散现象以及细胞肿胀有较大改善。说明姜黄-山楂能够改善肝脏脂肪病变。这同时与图5e、5f 中肝脏内AST、ALT 的降低互相佐证，姜黄-山楂能够起到对肝脏的保护作用。

图6 肝脏病理学切片（×400）Fig.6 Pathological section of the liver（×400）

2.7 附睾脂肪病理学分析

如图7 所示，脂肪病理学切片显示，正常组小鼠附睾脂肪细胞排列整齐、大小均匀，细胞质充盈，未见明显异常。正常干预组，细胞无明显异常，细胞体积明显小于正常组细胞。与正常组相比，高脂组细胞体积明显增大，细胞质减少，排列散乱，细胞大小不一。与高脂组相比，高脂干预组在细胞形态有明显改善。虽然存在细胞大小不均的情况，但细胞质充盈，排列紧密，细胞有减小情况。

图7 附睾脂肪病理学切片（×200）Fig.7 Fat pathology section of epididymis（×200）

2.8 姜黄联合山楂对肝脏脂代谢相关信号通路的影响

胆固醇的相关基因是调节脂代谢至关重要的作用机制[38]，研究表明，胆固醇被转移到高密度脂蛋白颗粒中，并返回肝脏主要通过限速酶胆固醇CYP7A1转化为胆汁酸[39]。胆固醇同时受胆汁酸分泌的影响，LXRα 调节胆汁酸的合成且能够调控SREBP1C基因的表达[40]。SREBP2、SREBP1C在胆固醇的代谢中发挥重要作用且表达量较高[41]。SCD1可介导脂肪的积累，SCD1的表达对脂代谢具有重要影响[42]。FAS异常表达会导致肝脏脂质累积[43]。由图8 实验结果可以看出，与正常组相比，高脂组肝脏中CYPTA1mRNA 表达水平高度显著下降（P＜0.001），与高脂组相比，高脂干预组CYPTA1mRNA 表达水平显著上升（P＜0.05）。与高脂组相比，高脂干预组LXRα和SREBP1CmRNA 表 达水平极显著下调（P＜0.01）。与SREBP1C功能相似，姜黄-山楂的干预可调节SCDmRNA，降低SCDmRNA 表达水平，差异高度显著（P＜0.001）。其中SREBP2表达水平无显著变化。此外本研究还测定了脂肪酸合成酶的相对表达量，与正常组相比，高脂组FASmRNA 表达水平高度显著上升（P＜0.001），相比高脂组，高脂干预组FASmRNA 表达水平高度显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）。因此推测姜黄协同山楂减肥的作用机制可能和CYPTA1、LXRα、SREBP1C、SCD、FASmRNA 表达水平有关。

图8 肝脏组织中CYP7A1、LXRα、SREBP2、SREBP1C、SCD、FAS mRNA 水平Fig.8 CYP7A1,LXRα,SREBP2,SREBP1C,SCD,FAS mRNA levels in liver tissue

3 结论

姜黄-山楂联用能够有效减缓高脂饮食小鼠体质量的增加，抑制小鼠血清中脂质水平的升高，控制小鼠的随机血糖水平，能够有效减少体内的脂肪积累、提高瘦肉率的转化，从而达到预防肥胖的作用。其机制与姜黄-山楂联用上调CYPTA1mRNA 的表达量和下调LXRα、SREBP1C、SCD、FASmRNA 表达量有关。从生理生化、病理学以及肝脏组织中mRNA的测定结果表明，姜黄和山楂联用对C57 小鼠的减肥作用可能是调节脂代谢起到的作用，但机制的探索还需从蛋白水平以及转录组学等进行深入研究。关于中草药在动物实验中，多以提取物或已经工业化生产的制剂为研究对象，这可能会导致某些功能成分的损失。本实验采用的是全粉进行干预，这为开展以全药粉为加工工艺的工业化应用提供了依据，减少了加工过程中的原料损失。