槐提取物和维生素C 组合物对紫外照射诱导的HaCaT 细胞光损伤的保护作用

孙 璇，李 萍，孙 静，郑嘉妮，余丹阳，张艳美，陈 朋,

（1.仙乐健康科技股份有限公司，广东汕头 515000；2.汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041）

随着生活水平的提升，人们对皮肤健康和管理的关注度与日俱增。紫外线辐射作为主要的外源性老化因素对皮肤的伤害长期存在，与人体皮肤的生理病理状态关系最为密切。维生素C（Vitamin C，VC），又称为抗坏血酸，是人体健康必需的微量营养素，天然VC主要来源于柑橘类水果和蔬菜[1]，有提高免疫力、预防细菌和病毒感染等作用。作为人体内最重要的水溶性维生素之一，VC具有抗氧化、减轻炎性反应、光保护、抗衰老和抗色素沉着的作用，在皮肤健康方向也起着重要作用[2]。槐（Sophora japonicaL.）是一种高大的多年生乔木，因其具有观赏、药用和食用价值而受到关注[3]。花/花芽具有外观美观、气味芳香、口感独特、保健功能优良等优点，在改善氧化应激，调节黑色素沉淀，修复紫外线辐射损伤等方向具有显著作用[4-6]。近年来的研究表明，槐米中提取的多糖具有保护HaCaT 细胞免受UVB 照射诱导的损伤[5]。槐花中的主要成分芦丁被认为可以降低顺铂导致的HMCs 细胞的氧化损伤[7]。因此，VC和槐提取物有抗氧化功效，具有对皮肤的光保护作用。

此外，有研究表明芦丁和VC联用对超氧阴离子自由基的清除或对脂质过氧化的抑制呈浓度依赖性，且芦丁与VC组合可以产生超加性效应[8]。芦丁和VC组合物在紫外辐照的人类皮肤成纤维细胞中也表现出保护作用，二者联用对促炎信号蛋白的过度表达和DNA 重组/表达有抑制作用[9]。Zhang 等[10]的研究表明槐花和VC组合物显著提高运动训练小鼠血清中SOD 活性，且其抗氧化能力较单一物料处理组具有更好的效果。可见，槐提取物与维生素C 组合物有一定的协同抗氧化作用，可能对紫外线照射造成的皮肤光氧化损伤有效。

本实验室之前的实验研究表明，槐提取物和VC组合物可以促进紫外照射后皮肤成纤维细胞弹性蛋白的生成，且槐提取物和VC组合物的质量比为1:1 时有协同增效的作用。为进一步探究槐提取物和VC特定比例组合物对人体皮肤细胞的影响，本研究以槐提取物和VC为实验材料，以HaCaT 细胞为研究对象，通过检测槐提取物、VC及其组合物对UV 导致的光损伤的抗氧化保护与抗炎的初步探究，为槐提取物和维生素C 组合物的开发和利用提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

槐提取物 河南中大恒源生物科技股份有限公司（10%芦丁，水提、包埋、干燥等工艺制备）；维生素C（合成）帝斯曼江山制药（江苏）有限公司；胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶/EDTA、青霉素/链霉素、DMEM 培养基 Gibco 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）普诺赛生命科技有限公司；6-羧基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）Thermo Fisher Scientific 公司；人白介素-6（IL-6）Elisa 试剂盒 RD systems 公司；MitoSOX™ Red Invitrogen 公司；鼠源Anti-Thymine Dimer 抗体 Abcam 公司；Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、抗荧光淬灭封片液（含DAPI）Beyotime Biotechnology 公司；即用型正常山羊血清 武汉博士德生物工程有限公司；永生化人角质形成细胞（HaCaT）普诺赛生命科技有限公司。

Axio Vert.A1 倒置荧光显微镜、LSM 880 激光共聚焦显微镜 ZEISS 公司；Spark®多模式微孔板酶标仪 TECAN 公司；CL-3000L 紫外交联仪Analytik Jena 公司；Forma 3111 二氧化碳培养箱Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 槐提取物及维生素C 组合物对UV 诱导的HaCaT 细胞ROS 的影响

1.2.1.1 细胞内总ROS 水平的测定（酶标仪检测）取对数生长期生长到80%的HaCaT 细胞，以1.5×104个/孔接种于黑壁透明板底的96 孔板。5% CO2的37 ℃培养箱中培养24 h。细胞随机分为对照组、模型组（UVA 组）及槐提取物处理组（槐提取物组）、维生素C 处理组（VC组）、槐提取物和VC组合物处理组（槐提取物+VC组，质量比为1:1）。弃去上清液，10 mmol/L PBS 洗涤1 次，模型组及不同实验组加入适量PBS 覆盖细胞，模型组和各实验组置于10 J/cm2UVA（波长为365 nm）照射[11]，UVA 照射结束后30 min，未接受辐照的对照组和UVA 照射的模型组加入100 μL DMEM 基础培养基继续培养，实验组加入100 μL DMEM 基础培养基配制的125 μg/mL 槐提取物溶液、125 μg/mL VC溶液、总浓度为125 μg/mL 槐提取物和VC组合物溶液，对照组加入DMEM 基础培养基。实验组的处理浓度按照实验室之前的研究得出。所有组别继续培养30 min。弃去上清，加入50 μL 含5 μmol/L 的H2DCFDA 的DMEM 基础培养基，37 ℃避光孵育30 min。多模式微孔板酶标仪（激发光波长Ex/发射光波长Em=488/530）测定各孔荧光值，并按照下式计算细胞内ROS 抑制率[12]：

式中：T-受试样品荧光强度；C-模型组荧光强度；C0-对照组荧光强度。

1.2.1.2 细胞内总ROS 水平的测定（荧光显微镜观察）取对数期HaCaT 细胞，以6×105个/孔接种于35 mm 培养皿，后续操作与上述类似，H2DCF-DA 探针处理后，PBS 洗涤2 次，荧光显微镜下拍照[13]。

1.2.2 线粒体ROS（Mitochondrial DNA，mtROS）水平的测定 取对数生长期生长到80%的HaCaT 细胞，以1.5×104个/孔接种于共聚焦培养皿中，培养24 h。细胞随机分为对照组、模型组及实验组。模型组和实验组经10 J/cm2UVA 照射。模型组加入1 mL 基础培养基，实验组加入1 mL DMEM 基础培养基配制的125 μg/mL 槐提取物溶液、125 μg/mL VC溶液、总浓度为125 μg/mL 槐提取物和VC组合物溶液（质量比为槐提取物:VC=1:1）培养箱中孵育30 min。吸去培养基，PBS 缓冲溶液洗3 次；加入500 μL 含MitoSOX™ Red 终浓度为10 μmol/L 的DMEM 基础培养基，37 ℃孵育30 min。30 min 后，吸去上清，用37 ℃预热PBS 漂洗3 次，加入1 mL PBS。激光共聚焦显微镜观察并拍照[14]，Image-J 软件分析各组的平均荧光强度（Mean fluorescence intensity，MFI），并计算mtROS 抑制率，计算公式如实验方法1.2.1。

1.2.3 环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane pyrimidine dimers，CPDs）含量的测定 24 孔板加入细胞爬片，HaCaT 细胞以1.5×105个/孔的密度种于孔板，培养24 h。细胞随机分为对照组、模型组及实验组。模型组和实验组经30 mJ/cm2UVB（波长为302 nm）照射[15-16]。实验组加入DMEM 基础培养基配制的125 μg/mL槐提取物溶液、125 μg/mL VC溶 液、125 μg/mL 槐提取物和VC组合物溶液培养箱中孵育30 min。PBS 洗涤3 次。每孔加入1 mL 预冷4%多聚甲醛，室温固定20 min；吸弃多聚甲醛，PBS 漂洗3 次，5 min/次。加入1 mL 0.1% PBST，室温放置15 min；PBS 漂洗3 次，5 min/次。每孔加入1 mL 2 mol/L 盐酸（现配现用），室温放置10 min；吸弃盐酸，PBS 漂洗3 次，5 min/次。加入50 μL 山羊血清封闭，覆盖盖玻片，室温封闭1 h。吸弃封闭液，加入5%牛血清蛋白（BSA）稀释的鼠源CPD 抗体，覆盖盖玻片，置于抗体孵育湿盒中，4 ℃过夜。PBS 漂洗3 次，5 min/次。加入5% BSA 稀释的荧光二抗（Alexa Fluor488 标记的山羊抗鼠IgG），室温避光孵育1 h；吸弃二抗，PBS 漂洗3 次，5 min/次。用含DAPI 的抗荧光淬灭剂封片。观察并拍照，Image-J 软件分析各组的MFI。

1.2.4 细胞因子IL-6 分泌水平的测定 HaCaT 细胞按照5×106浓度接种于10 cm 细胞培养皿中。10 J/cm2UVA 照射结束后DMEM 基础培养基配制的125 μg/mL 槐提取物溶液、125 μg/mL VC溶 液、125 μg/mL 槐提取物和VC组合物溶液，置于培养箱中继续培养6 h[17]。按照IL-6 Elisa 检测试剂盒检测IL-6 的含量。

1.3 数据处理

实验数据至少3 次重复，实验结果用Graphpad 8.0.0 统计软件分析并绘图，结果以mean±SD 表示，统计方法为单因素方差分析（One-way，ANOVA）。*P＜0.05、**P＜0.01、#P＜0.05、##P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 槐提取物和维生素C 组合物对HaCaT 细胞ROS 的影响

具有细胞膜渗透性的ROS 荧光检测探针H2DCFDA 进入细胞后，被水解生成DCFH 而无法穿过细胞膜，从而被装载到细胞内，ROS 可将DCFH 氧化成在激发时发出绿色荧光产物DCF，因此DCF 的荧光强度可反映细胞内ROS 水平[18]。如图1a 所示，对照组几乎无荧光，UVA 处理后绿色荧光强度明显增强，说明细胞内ROS 含量明显增加，UVA 诱导的氧化应激导致细胞内ROS 含量增加。与UVA 组相比，槐提取物、VC及组合物处理组荧光明显减弱，其中槐提取物和VC组合物组荧光最弱。结果表明，UVA 照射增加细胞内ROS 的含量，槐提取物、VC及组合物均可降低细胞中ROS 含量，且组合物的ROS 清除效果最好。如图1b 所示，UVA 处理后，槐提取物的ROS 抑制率为38.23%±9.23%；VC的ROS抑制率为27.20%±6.87%；组合物的ROS 抑制率为64.13%±4.08%，槐提取物、VC及其组合物显著降低UVA 导致的ROS 生成（对照组vs.槐提取物，P＜0.01；对照组vs.VC，P＜0.01；对照组vs.组合物，P＜0.01）。结果表明，UVA 照射后，组合物组ROS 清除率极显著高于单一组分处理组（组合物vs.槐提取物，P＜0.01；组合物vs.VC，P＜0.01）。荧光显微法与酶标仪检测均显示槐提取物和VC组合物对于ROS 的清除效果最好。多酚（包括芦丁）和VC可显著降低抗氧化蛋白（如硫氧还蛋白和戊二醛）在细胞中的表达，硫氧还蛋白还原酶是一种在氧化应激下恢复细胞中还原硫氧还蛋白水平的酶[9]。因此，槐提取物和VC可支持抗氧化系统。槐花/槐米中含有丰富的芦丁，芦丁作为一类黄酮类物质，通过增加抗氧化（如SOD、TrxR 和Prx1/2）和炎症反应（如IL-17F、PAK2和YWHAZ）相关蛋白总表达的增加发挥保护作用[19]。此外，芦丁通过恢复照射后增加的p53、细胞色素c、细胞周期和凋亡调节蛋白2 的生理水平，部分防止紫外线诱导的细胞凋亡[19]。VC可以抑制紫外辐照诱导的表皮角质形成细胞中SOD、CAT、GST 和GSH-Px活性的降低，从而维持细胞内抗氧化防御系统[20-21]。一项关于芦丁和VC联用对紫外诱导氧化应激的HaCaT 细胞保护作用的研究表明芦丁与VC组合物导致UVB 照射的HaCaT 细胞中超氧阴离子的生成减少约60%，优于芦丁和VC的单独作用[22]。本研究表明，槐提取物和VC对UVA 紫外辐射导致的细胞氧化损伤也具有保护作用，二者单独使用可减少细胞ROS 及mtROS 的生成，对紫外辐照导致的氧化损伤起到保护作用。此外，本研究将槐提取物与VC进行特定比例配比，探究出一种对于对紫外线辐射导致的细胞氧化损伤具有更强保护作用的复合物。

图1 槐提取物、维生素C 及其组合物对UVA 照射HaCaT 细胞ROS 含量的影响（n=4）Fig.1 Effects of Sophora japonica L.,vitamin C and combination on ROS generation in UVA irradiated HaCaT cells (n=4)

2.2 槐提取物和维生素C 组合物对HaCaT 细胞mtROS 的影响

如图2 所示，红色荧光表示线粒体内超氧阴离子含量，对照组几乎无荧光，UVA 组的荧光强度显著增强，槐提取物、VC及组合物处理后荧光强度显著减弱，其中槐提取物和VC组合物处理组的荧光强度弱于单一物料处理组。UVA 照射后，HaCaT 细胞mtROS 含量增加，分别给予槐提取物、VC及其组合物处理后mtROS 抑制率分别为50.29%±4.92%、38.81%±8.66%、84.74%±3.68%，均可一定程度上减少线粒体ROS 的生成，其中槐提取物和VC组合物处理组效果最佳（槐提取物+VCvs.槐提取物，P＜0.01；槐提取物+VCvs.VC，P＜0.01）。线粒体膜是细胞内ROS 的重要来源[23]。研究表明，VC对线粒体具有多种有益作用，包括直接清除ROS 以及基于分散在基质和膜中的其他线粒体抗氧化剂的再循环的关键作用[23]。VC对线粒体的复杂调节可能有助于多功能的抗氧化反应，从而为维生素提供核心作用，以充分控制与线粒体ROS 产生增加相关的线粒体功能障碍[24]。本研究也表明，槐提取物、VC及其组合物可抑制mtROS 的生成，且组合物具有一定的加成效果。

图2 槐提取物、维生素C 及其组合物对UVA 照射HaCaT 细胞线粒体ROS 含量的影响（n=3）Fig.2 Effects of Sophora japonica L.,vitamin C and combination on mitochondrial ROS generation in UVA-irradiated HaCaT cells (n=3)

2.3 槐提取物和维生素C 组合物对HaCaT 细胞内CPDs 水平的影响

如图3a 所示，UVB 照射后细胞中荧光强度明显增加，说明UVB 导致细胞中的CPDs 水平上升。与UVB 照射组相比，槐提取物、VC及其组合物处理后CPDs 的水平显著降低。对照组、模型组（UVB照射组）、槐提取物组、VC组及组合组的CPDs 的荧光强度分别为：6.95±0.80、23.22±1.23、13.10±1.21、15.75±0.44、9.17±0.47。与对照组比较，UVB 组细胞中CPDs 含量显著升高（P＜0.01），说明UVB 损伤模型造模成功；与模型组比较槐提取物组、VC组和组合组CPDs 含量均极显著下降（P＜0.01）；其中，槐提取物和维生素C 组合组效果显著优于单一组分处理组（P＜0.05）。以上结果表明，槐提取物、VC及其组合组均可降低UVB 照射导致的细胞中高水平的CPDs，其中组合物对DNA 损伤的保护作用最强。

图3 槐提取物、VC 及组合物对UVB 照射HaCaT 细胞CPDs 含量的影响（n=3）Fig.3 Effects of Sophora japonica L.,vitamin C and combination on CPDs content in UVB-irradiated HaCaT cells (n=3)

皮肤UVR 暴露导致DNA 损伤。CPDs 是UVR诱导DNA 损伤的代表产物，被认为是启动光致癌的分子触发器CPDs 的生成主要与UVB 有关，且主要生成于表皮层的细胞中[25-26]。核酸切除修复（NER）是紫外线诱导的DNA 损伤的主要修复途径，细胞着色性干皮病蛋白A（XPA）在NER 中其中不可或缺的作用[27-28]。研究表明VC可以上调细胞中sirtuin1（SirT1）蛋白的表达，而SirT1 通过与XPA 结合，将XPA 维持在低乙酰化状态，下调细胞中紫外线诱导的CPDs 的表达，在紫外线的NER 途径中起到积极作用[29]。苹果提取物显著降低导致紫外线照射体外皮肤外植体和3D 组织工程皮肤细胞中CPDs 的形成，这种保护作用可能与苹果提取物中的芦丁相关[30]。研究表明芦丁和VC联用有增强皮肤细胞的抗UVB 损伤的作用[9]。因此，两者联用对UVB 导致的DNA 损伤可能也有一定的加成效果。本研究也发现，UVB 照射则使细胞中的CPDs 含量显著增加。UVB 照射后给予槐提取物、VC及其组合物，可减少HaCaT 细胞中CPDs 的生成，说明槐提取物、维生素C 及其组合物可促进UVB 诱导的DNA 损伤修复，且组合物具有加成作用。

2.4 槐提取物和维生素C 组合物对HaCaT 细胞内IL-6 水平的影响

UV 作用于HaCaT 细胞，可激活转录因子NF-κB，促进多种炎症因子如IL-1、IL-6、IL-8 等的表达[31]。其中IL-6 是炎症反应过程中的促发剂，可促进T 细胞增殖与分化，刺激B 细胞分化产生抗体，参与机体的免疫应答[32]。如图4 所示，与对照组比较，UVA照射组细胞内IL-6 含量极显著升高（P＜0.01）；与UVA组比较，槐提取物处理组及组合物处理组细胞内IL-6 含量显著下降（P＜0.05），槐提取物处理组IL-6 水平下降最低（P＜0.01），其次组合物处理组（P＜0.05）。因此，组合物处理组在UVA 诱导的角质形成氧化应激模型中虽具有抗炎作用，但效果并不优于单用槐提取物处理组抗炎作用。

图4 槐提取物、维生素C 及其组合物对UVA 照射HaCaT 细胞IL-6 水平的影响（n=3）Fig.4 Effects of Sophora japonica L.,vitamin C and combination on IL-6 expression in UVA-irradiated HaCaT cells (n=3)

在生物相关的相互作用机制中，植物提取物联合使用可通过多靶点效应发挥互补增效的作用，包括介导不同信号通路或同一通路的不同下游环节。本研究发现本研究发现槐提取物和VC均具有抗氧化活性和抗炎作用，VC对抑制ROS、mtROS 的生成方面有优于槐提取物的趋势，其抗氧化活性更强，而槐提取物的抗炎作用强于VC。氧化应激与炎症反应间存在的错综复杂的调控通路，二者往往相互影响形成正反馈循环[33-34]。本文的研究结果表明，VC和槐提取物组合物抗氧化活性有明显提高，推测槐提取物和VC分别主要通过拮抗氧化应激和炎症反应发挥互补增效作用。然而，在抗炎方面本研究表明，VC有抗炎趋势，槐提取物有较好抗炎效果，VC和槐提取物联用后虽仍具有较好的抗炎作用，但与槐提取物相比，效果不突出。关于VC和槐提取物联用后抗氧化效果增强的机制需要进一步进行验证。

3 结论

本文通过分析槐提取物、VC及其组合物对紫外照射处理的HaCaT 细胞的抗氧化和细胞炎症因子分泌的影响。结果表明，槐提取物、VC及其组合物具有抑制由UVA 诱导产生的ROS 生成的作用，对细胞ROS 抑制率分别为38.23%±9.23%、27.20%±6.87%及64.13%±4.08%，对mtROS 抑制率分别为50.29%±4.92%、38.81%±8.66%及84.74%±3.68%。组合物对于ROS 的抑制作用优于单一物料处理。槐提取物、VC及其组合物显著降低由UVB 诱导产生的CPDs 的含量，其中组合物效果最佳。此外，槐提取物及槐提取物和VC组合物显著减低炎症因子IL-6 的分泌。该研究可为槐提取物及VC组合物的营养健康产品开发和应用提供实验支持。而未来的研究将聚焦在槐提取物和VC联用后抗氧化效果增强的机制进行深入研究与探讨。