超高效液相色谱-串联质谱法检测卤肉中4 种β-受体激动剂残留

孟春杨，吴玉田，彭 蕾，钟 雪，邹 璐，刘文政，周贻兵

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳 550004）

β-受体激动剂又称瘦肉精，是苯乙醇胺类化合物，该类药物可明显提高动物的瘦肉率，因此会被非法添加于畜禽类饲料中[1-3]。当人体食入含有β-受体激动剂的动物组织将会出现心悸、恶心、肌肉震颤和紧张等症状[4-6]。我国已禁止在畜禽类养殖中使用β-受体激动剂[7]，但在利益的驱使下，还是存在β-受体激动剂非法添加的情况[8-10]。

目前对于β-受体激动剂的检测方法，常用酶联免疫法[11-12]、气相色谱-串联质谱法[13-15]和液相色谱-串联质谱法[16-18]等。酶联免疫法假阳性率较高，气相色谱-质谱法需要进行衍生后测定，操作过程复杂，且检测灵敏度低，不适用于多种目标物同时分析[19-21]。相较于其他的检测技术，液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、选择性强、分析速度快和样品使用量少等优点，已经广泛应用于食品污染物监测[10,22-23]。市场监管部门对肉制品的监督检测主要是新鲜肉，一些在饲养中有非法添加的肉就存在制成卤肉售卖的风险。卤料成分极其复杂，因此卤肉基质效应大，容易受到干扰出现假阳性。目前动物源性食品中β-受体激动剂的国标检测方法（GB 31658.22-2022）[24]实验前处理操作过程繁琐，提取的样品溶液非缓冲盐体系，需要两次调节pH，两次氮吹复溶，操作繁琐耗时，不适合大批量样品的检测。近几年文献报道的QuEChERS EMR-Lipid 净化快速检测肉制品中β-受体激动剂的方法[25-27]，操作简单，但主要是除去样品中的脂肪，无法完全去除卤肉中的杂质，检测卤肉易出现假阳性。

为最大限度地消除基质干扰，本实验采用基质标准曲线，同时采用同位素内标矫正。采用基质标准曲线可使样品溶液和标准溶液有相同的离子化环境，从而减小基质效应[25-26,28]，采用与待测化合物相对应的同位素内标校正，同位素内标稀释技术提高了β-受体激动剂定量分析的准确性和回收率，消除基质的干扰[27,29-30]。本文在国标方法GB31658.22-2022 的基础上，简化了萃取步骤，且仅需调节pH 一次，氮吹复溶一次，建立了将卤肉样品用乙酸钠-醋酸缓冲液提取，仍采用经典的SLS 固相萃取柱净化，UPLC-MS测定卤肉中4 种β-受体激动剂的方法，为卤肉中β-受体激动剂的检测提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈 色谱纯，Thermo 公司；甲酸 色谱纯，中国阿拉丁公司；浓氨水 优级纯，沪试公司；乙酸乙酯、盐酸、乙酸钠、醋酸 均为分析纯，均为国药集团化学试剂有限公司；β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶 硫酸酯酶活性＜20000 units/mL，美国CNW；特布他林、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、D9-特布他林、D9-克仑特罗、D5-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇 均为TRC 加拿大公司，纯度均大于95%；卤肉：卤羊肉、卤牛肉、卤猪肉等 来自于贵州省的九个市州。

SLS 固相萃取柱（500 mg/6 mL）福州勤鹏生物科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish 美国安捷伦科技有限公司；Oasis MCX 固相萃取柱（500 mg/6 mL）、Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL）Waters 公司；Millipore A10 超纯水机 美国密理博公司；SCIEX 6500 三重四极杆串联质谱仪 美国AB SCIEX 公司；3-30KS 离心机 德国Sigma 公司；DMV-16 涡旋混匀仪 广东科寅设备有限公司；N-EVAP 氮吹仪 上海安普科技有限公司；SHA-C 水浴恒温振荡器 金坛市恒丰仪器厂；F2 pH 计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.1.1 混合标准储备溶液 分别准确称取0.010 g的特布他林、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的标准品于4 个10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到1000 mg/L 的各单标储备液。取各单标储备液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到10 mg/L 的混合标准储备溶液。临用前逐级稀释成10 μg/L 的混合标准使用液。

1.2.1.2 混合同位素内标储备液 分别准确称取0.010 g 的D9-特布他林、D9-克仑特罗、D5-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇标准品于4 个10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到1000 mg/L 的各同位素内标储备液。取各同位素内标储备液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到10 mg/L 的混合同位素内标储备溶液。临用前逐级稀释成100 μg/L 的混合同位素内标使用液。

1.2.2 样品的前处理 称取绞碎卤肉2.00 g 样品于50 mL 离心管中，加100 μL 100 μg/Lβ-受体激动剂混合同位素内标使用液静置10 min，加10 mL 0.2 mol/L pH5.2 的乙酸钠-醋酸缓冲液，均质20 s，加入20 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液，37 ℃水浴振荡器水解16 h，取出冷却，10000 r/min 离心10 min，取上清液，用3.0 mol/L 盐酸溶液调节pH 至2.0±0.1（pH 测定仪），10000 r/min 离心10 min，上清液待净化。

SLS 固相萃取柱依次用5 mL 水、5 mL 甲醇、5 mL 水、5 mL 40 mmol/L 的盐酸溶液活化后，取5 mL 上述样品上清液至柱内过柱，然后用5 mL 水、5 mL 甲醇依次淋洗除杂，抽干，用10 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于10 mL 聚丙烯离心管中，50 ℃水浴中氮吹干。初始流动相复溶，涡旋混匀，0 ℃ 7000 r/min 离心5 min，上清液进UPLC-MS 测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流速0.3 mL/min；流动相A 为0.1%甲酸-水；流动相B 为乙腈；梯度洗脱条件：0～0.5 min 95%A，0.5～8.0 min 95%的A 线性变化为40%，8.0～9.0 min 40%A，9.1～13.0 min 95%A。

1.2.3.2 质谱条件 离子源：ESI+；离子化电压：4500 V；气帘气压强：35 psi；喷雾气压强：50 psi；辅助加热气压强：50 psi；碰撞气：Medium。多反应监测（MRM）模式进行采集。

1.3 数据处理

UPLC-MS 配有SCIEX OS 数据处理软件建立标准曲线、计算结果，采用Microsoft Excel 处理数据及绘制图表。谱图为Photoshop 作图软件绘制。本文净化柱的选择和回收率均采用6 个平行样品计算。

2 结果与分析

2.1 液相条件的确定

在电喷雾离子源正离子模式下，流动相中加入适量甲酸可增强待测组分离子化效率，提高检测响应强度，且乙腈比甲醇有更强的洗脱能力，因此选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，4 种β-受体激动剂的色谱峰形和响应信号的强度也较好。调整洗脱程序，使各组分分离，优化后的色谱条件见1.2.3.1，优化后的谱图如图1 所示。

图1 4 种 β-受体激动剂的离子流色谱图Fig.1 Ion chromatograms of 4 kinds of β-agonists

2.2 质谱条件的确定

选择ESI+模式对目标物进行质谱扫描。将质量浓度为50 μg/L 的各标准液进入质谱，通过Q1 扫描找到各目标物的母离子，再对母离子施加一定的碰撞能量进行Product Ion（MS2）扫描，获得各自的二级碎片离子，选择2 个信号较强且干扰小的碎片离子与其母离子组成监测离子对。优化碰撞能量、锥孔电压等各项质谱参数，建立MRM 的检测模式。最终确定的离子对信息及质谱参数如表1 所示。

表1 质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters

2.3 净化条件的选择

本课题组李磊等[31]已确证QuEChERS EMRLipid 净化HPLC-MS 测定猪肉猪肝中β-受体激动剂简便可行，在实验中发现此净化方法测定卤肉中β-受体激动剂，高检出率和同一样品同时检出多种β-受体激动剂，数据可疑，可能出现假阳性。如图2所示，同一卤肉样品经SLS 柱净化后上机为a 图，克伦特罗和莱克多巴胺均未检出。QuEChERS EMRLipid 净化后上机如b 图，在5.28 min 处出峰，说明莱克多巴胺有检出；在5.74 min 处出峰，说明克伦特罗有检出。采用国标法对这一卤肉样品进行净化复检，克伦特罗和莱克多巴胺均未检出。结果证实QuEChERS EMR-Lipid 净化虽然快速简便，但清除不干净卤肉样品中杂质，容易导致假阳性结果，不适合卤肉样品的净化。QuEChERS EMR-Lipid 是一种分散固相萃取技术，原理是特殊聚合物基质EMR 专门吸附脂质中C5 及以上的碳链，对脂质具有非常强的选择吸附性，主要用途是在前处理过程中去除食品基质中的脂质。而经典的SLS 柱是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而能更加完全地清除杂质，更适用于复杂基质。

图2 SLS 柱净化上机（a）和QuEChERS EMR-Lipid 净化上机（b）的MRM 离子提取色谱图Fig.2 MRM extracted ion chromatograms of SLS column purification (a) and QuEChERS EMR-Lipid purification (b)

为了使目标化合物的定量分析更加准确，采用的净化柱要能够降低或消除样品基质带来的干扰。肉类中β-受体激动剂的前处理多采用PXC 柱、HLB 柱、SLS 柱、MCX 柱、QuEChERS EMR-Lipid等净化，本研究排除了QuEChERS EMR-Lipid，又对比了SLS 柱、HLB 柱和MCX 柱净化的效果。对加标量5.0 μg/kg 空白卤牛肉的净化效率，平行测定6 次，对比其平均回收率，RSD 在1.23%～7.92%之间，结果见图3。

图3 不同类型净化柱的回收率Fig.3 Average recovery of different purification columns

结果显示：HLB 柱净化，4 种β-受体激动剂的回收率都不高，这是因为HLB 柱是共价键结合分配原理，不适用于β-受体激动剂这类中等强极性化合物[32]。SLS 柱和MCX 柱净化均为强阳离子交换柱，但SLS 柱的回收率为89.2%～97.9%优于MCX 柱的83.2%～90.4%（详细结果见图3），因此选择SLS柱作为净化柱。

2.4 标准曲线、检出限与定量限

取适量的10 μg/L 的混合标准使用液和100 μg/L的混合同位素内标使用液，用空白基质溶液配制成含混合内标5 μg/L 的0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、9.5 μg/L基质匹配标准系列溶液。以系列标准溶液中分析物的浓度（μg/L）与对应的同位素内标的峰面积比值绘制校正曲线，按内标法计算试样中β-受体激动剂含量。以3 倍信噪比计算方法的检出限（3S/N），以10倍信噪比计算方法的定量限（10S/N），结果见表2。

表2 β-激动剂线性方程、检出限和定量限Table 2 Linear equation,detection limit and quantitation limit of β-agonists

由表2 可知4 种β-受体激动剂在0.5～9.5 μg/L浓度范围内r值＞0.9988，计算特布他林、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检出限均为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。与部分已有方法[21,29]相比检出限和定量限更低，定量更为精准可靠。

2.5 回收率与精密度

在2.0 g 空白卤肉样品中加入1、5、9 μg/kg 的3 个不同浓度水平的4 种β-受体激动剂标准溶液，同时加入含有和标准曲线相同浓度的内标溶液，每个浓度水平平行测定6 次，计算回收率及测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。

表3 β-激动剂回收率与精密度结果Table 3 Spiked recoveries and RSDs of β-agonists

由表3 可知，4 种β-受体激动剂的回收率在87.9%～113.7%之间，RSD 在1.48%～9.32%之间，表明方法回收率和精密度良好。

2.6 实际样品测定

从贵州省的九个市州每个市（州）采集18 份样本，其中18 份样本要求区域内的每个县（区）至少采集2 份，所有采集的样本均为当地集市随机抽取。用SLS 固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法对采集的162 批次卤肉试样（有卤羊肉，卤牛肉，卤猪肉等）中的4 种β-受体激动剂进行检测，结果有2 份阳性样品。其中采自遵义市农贸市场的一份卤猪蹄样品克伦特罗含量为1.51±0.16 μg/kg，莱克多巴胺为3.65±0.28 μg/kg；另外一份采自遵义市农贸市场的卤羊肉样品克伦特罗含量为11.5±0.29 μg/kg。用国标方法对阳性样本进行复检，卤猪蹄样品克伦特罗含量为1.56±0.07 μg/kg，莱克多巴胺为3.51±0.15 μg/kg；卤羊肉样品克伦特罗含量为11.7±0.20 μg/kg。食品中兽药最大残留限量标准GB 31650-2019和食品中41 种兽药最大残留限量GB 31650.1-2022中克伦特罗、特布他林、莱克多巴胺、沙丁胺醇都是禁用药物，而本实验在卤肉中检出，已有食品风险安全隐患，相关部门应引起重视。

3 结论

本研究建立了SLS 固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法检测卤肉中克伦特罗、特布他林、莱克多巴胺、沙丁胺醇4 种β-受体激动剂残留的方法，并对仪器条件以及前处理方法进行了优化。该方法能有效地除去基质干扰，检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg，加标回收率在87.9%～113.7%之间，相对标准偏差1.48%～9.32%。该方法方便快速、准确可靠，满足实际样品检测要求，可为卤肉中β-受体激动剂类化合物兽药残留的监测提供技术支撑，有助于卤肉中β-受体激动剂类化合物兽药残留的市场监管。