痰TB-RNA在继发性活动性肺结核患者中的应用

【摘要】 目的 比较结核分枝杆菌RNA（TB-RNA）等四种检测方法在继发性活动性肺结核患者中的检出率，探讨TB-RNA在继发性活动性肺结核中的应用价值。

方法 选取2022年11月至2024年5月在广西胸科医院结核科住院的继发性活动性肺结核患者283例。留取合格的痰标本，分别进行涂片、固体培养、TB-RNA和Xpert检测。剔除检测结果不全者后，最终获得资料完整的病例245例。将TB-RNA检测灵敏度与涂片、固体培养和Xpert结果进行比较分析；使用Kappa检验评估涂片、TB-RNA、Xpert和固体培养结果的一致性。

结果 以临床诊断为参考标准，TB-RNA灵敏度（55.10%）高于培养（47.76%）和涂片（36.73%），其差异有统计学意义（P＜0.05）；但低于Xpert（74.69%），此差异也有统计学意义（P＜0.05）。TB-RNA的准确率为84.49%，高于涂片（75.92%）和Xpert（68.98%）。Kappa一致性分析结果显示，TB-RNA与培养结果的一致性最高（0.691），其次为涂片（0.513）和Xpert（0.393）。

结论 TB-RNA的检测灵敏度相较于传统方法有一定优势，尽管现阶段尚不能完全取代结核分枝杆菌分离培养，但它具有独特的技术特点和优势，可用于继发性活动性肺结核患者的辅助诊断。

【关键词】 TB-RNA；活菌；活动性肺结核；Kappa分析

中图分类号：R529.9"" 文献标志码：A"" DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.12.007

Application of sputum TB-RNA in patients with secondary active pulmonary tuberculosis

[HJ1*2][HJ]

ZHOU Youa， HE Xib， HUANG Lihuac， LUO Lanboc， HU Minc，

CHEN Guibinc， LIU Aimeid， YANG Xiaobinga

（a. Science and Education Biology Sample Library， b. Department of Thoracic and Cardiac Surgery，

c. Department of Medical Laboratory， d. Office of Hospital Director， Chest Hospital of

Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou 545005， Guangxi， China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】 Objective To compare the detection rate of Mycobacterium tuberculosis RNA （TB-RNA） and other three detection methods in patients with secondary active pulmonary tuberculosis， so as to explore the application value of TB-RNA secondary active pulmonary tuberculosis.

Methods A total of 283 patients with secondary active tuberculosis who were hospitalized in the Tuberculosis Department of Chest Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region from November 2022 to May 2024 were selected. Qualified sputum specimens were collected for smear， solid culture， TB-RNA and Xpert detection. After excluding incomplete test results， 245 cases with complete data were obtained. The sensitivity of TB-RNA was compared with that of smear， solid culture and Xpert， and consistency of smear， TB-RNA， Xpert， and solid culture results were assessed by Kappa tests.

Results Taking clinical diagnosis as reference standard， the sensitivity of TB-RNA （55.10%） was higher than that of culture （47.76%） and smear （36.73%）， and difference was statistically significant （Plt;0.05）， but it was lower than that of Xpert （74.69%）， and the difference was also statistically significant（Plt;0.05）. The accuracy of TB-RNA was 84.49%， which was higher than those of smear （75.92%） and Xpert （68.98%）. Kappa consistency analysis showed that the consistency of TB-RNA and culture results was the highest （0.691）， followed by that of smear （0.513） and Xpert （0.393）.

Conclusion Compared with traditional methods， the sensitivity of TB-RNA has certain advantages， although it can not completely replace the isolation and culture of Mycobacterium tuberculosis at present， but it has its own technical characteristics and advantages， which can be used for auxiliary diagnosis of patients with secondary active pulmonary tuberculosis.

【Keywords】 TB-RNA; live bacteria; active pulmonary tuberculosis; Kappa analysis

肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性呼吸道传染病，是结核病的主要类型。肺结核的传播主要由活动性肺结核引起［1］。因此，及早发现并积极治疗活动性肺结核对于结核病的防控具有重要意义［2］。结核病，特别是耐药性结核病，治疗周期长，治疗费用高，药物副作用也对患者个人、家庭和社会造成了沉重负担［3-4］，对人类身心健康构成了严重威胁。随着结核病实验室诊断技术的发展，已有多种类型的检测技术应用于临床诊断［5］，并不断涌现出新的诊断技术［6-8］。然而，直到目前为止，对于结核病的诊断仍然存在一定的困难。结核分枝杆菌RNA（Mycobacterium tuberculosis RNA，TB-RNA）检测是一种以RNA为靶标的RNA恒温扩增技术。由于RNA在环境中易降解［8-9］，与DNA检测相比，TB-RNA检测具有更少污染的可能。同时，只有TB-RNA检测和结核分枝杆菌培养可以进行活菌检测［8］。本研究的目的是探索TB-RNA在继发性活动性肺结核患者中的应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取2022年11月到2024年5月在广西胸科医院结核科住院的283例肺结核患者，均经《肺结核诊断》（WS 288—2017）［10］和结核病分类（WS196—2017）［11］确诊为继发性活动性肺结核。留取合格的痰标本，分别进行涂片、固体培养、TB-RNA和Xpert检测。剔除检测结果不全的病例后，最终得到资料完整的245例病例。其中男性205例，女性40例，年龄范围为18至84岁，平均（52.05±14.94）岁。本研究已获得医院伦理委员会批准，伦理批号为2021-014，所有入组患者均签署了知情同意书。

1.2 仪器与试剂

上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96S全自动医用PCR系统；郑州中普医疗器械有限公司生产的结核分枝杆菌显微扫描仪ZOPOMED-240；GeneXpert全自动医用PCR分析系统（Infinity-48s），配套原装GeneXpert MTB/RIF试剂；上海仁度生物科技股份有限公司生产的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）；珠海贝索金胺O染色液、珠海贝索中性罗氏培养基、N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠（NALC-NaOH）混合溶液（由6%的NaOH溶液和2.9%的柠檬酸钠溶液等体积混合，每100 mL混合溶液中加入0.5 g NALC粉末溶解），pH值为6.8的磷酸盐缓冲液。

1.3 检测方法

1.3.1 痰涂片

按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［12］中的标准操作程序执行，采用直接涂片法。随后，使用金胺O染色液进行染色。待染色完成后，使用结核分枝杆菌显微扫描仪ZOPOMED-240进行自动阅片，阳性结果需由人工镜检进一步确认。

1.3.2 痰固体培养

采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠法对痰标本进行消化处理，并依据《结核病实验室检验规程》［13］中的标准操作程序执行。对生长的菌落进行涂片和染色，以确认是否为抗酸杆菌，同时使用噻吩-2羧酸肼（TCH）和对硝基苯甲酸（PNB）进行生长试验，以进行菌种鉴定。

1.3.3 痰TB-RNA检测

取1 mL痰液加入约2倍体积的NaOH处理液（4%），旋涡振荡30秒后静置30分钟，使痰液充分液化。吸取1 mL液化后的标本加入1.5 mL无菌EP管中，离心去上清液，加入1 mL无菌生理盐水进行第一次洗涤，离心去上清液，加入50 mL RNA裂解缓冲液。与阳性对照、阴性对照（分别加入50 mL RNA裂解缓冲液）一起超声15分钟（功率300 W），然后以12 000×转离心5分钟，上清即为扩增核酸模板。采用结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增），按照试剂盒说明书进行操作。取2 μL上述核酸模板加入提前配置好的30 μL扩增反应液中，在60 ℃下反应10分钟，42 ℃下反应5分钟，随后打开盖子加入10 μL配套的酶液，转置于SLAN-96S荧光检测仪，设置42 ℃恒温扩增检测。Ct值＜40为阳性，Ct值≥40为阴性。

1.3.4 痰Xpert检测

使用GeneXpert全自动医用PCR分析系统（Infinity-48s），配套原装GeneXpert MTB/RIF试剂，按试剂配套说明书操作。取适量痰标本，按1∶2比例加入配套的样本处理液，拧紧盖子，漩涡振荡混匀30秒，室温静置15分钟，使样本充分液化。吸取2 mL液化后的样本加入检测试剂盒中，上机检测。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析和处理，GraphPad Prism 8软件用于作图。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，治疗前后组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用两独立样本t检验，计数资料以频数（n）和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验、连续校正公式或Fisher精确概率法。使用Kappa一致性检验评估涂片、TB-RNA、Xpert与固体培养结果的一致性。Kappa值在0～0.20为极低一致性，0.21～0.40为一般一致性，0.41～0.60为中等一致性，0.61～0.80为高度一致性，0.81～1.00为几乎完全一致。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异性=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%；阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%；准确度=（真阳性例数+真阴性例数）/（真阳性例数+真阴性例数+假阴性例数+假阳性例数）×100%。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结" 果

2.1 痰TB-RNA检测灵敏度与涂片、固体培养、Xpert的对比

以临床诊断为参考标准，灵敏度从高到低依次为Xpert、TB-RNA、固体培养和涂片。TB-RNA的灵敏度为55.10%，高于固体培养的47.76%和涂片的36.73%，两者之间差异有统计学意义（χ2=119.613，P＜0.001；χ2=79.232，P＜0.001）。但TB-RNA的灵敏度低于Xpert（74.69%），其差异也有统计学意义（χ2=74.234，P＜0.001）。在74例涂阳培阳的肺结核患者中，TB-RNA和Xpert的阳性率均为100%（74/74）。在43例涂阴培阳的患者中，TB-RNA检出33例（76.74%），Xpert检出38例（88.37%）。在112例涂阴培阴的患者中，TB-RNA检出19例（16.96%），Xpert检出57例（50.89%）。结果见表1、图1。

2.2 以固体培养及菌种鉴定结果为参考标准进行分析

TB-RNA的灵敏度为91.45%，高于涂片的63.25%，两者之间差异有统计学意义（χ2=15.960，P＜0.001）。同时，TB-RNA的灵敏度低于Xpert的95.73%，该差异也有统计学意义（P＜0.05）。TB-RNA的阴性预测值为90.91%，高于涂片的72.26%，但低于Xpert的91.94%。TB-RNA的准确率为84.49%，高于涂片的75.92%和Xpert的68.98%。Kappa一致性分析结果显示，TB-RNA与固体培养结果的一致性最高，为0.691，其次为涂片的0.513和Xpert的0.393。结果见表2。

3 讨" 论

随着分子生物学技术的日益成熟，已经建立了一些高特异性和高灵敏度的分子检测方法，这为结核病的防治工作提供了极大的帮助［6-7］。16S rRNA存在于所有原核生物中，常用于细菌的种类鉴定和分类［14］。TB-RNA检测以结核分枝杆菌中特异的16S rRNA作为检测靶标，可以有效区分样本中的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。该方法是目前唯一的活菌分子检测手段，具有高灵敏度、高特异性和低假阳性率等优点。

以固体培养及菌种鉴定结果为参考标准，TB-RNA的灵敏度高于涂片，低于Xpert，与邹远妩等［15］的研究结果相似。在112例涂阴患者中，TB-RNA检出19例，Xpert比TB-RNA多检出38例。因此，TB-RNA的检测灵敏度相较于传统方法有一定优势，但仍低于Xpert。这是因为TB-RNA检测的靶标为样本中结核分枝杆菌活菌中的16S rRNA，因此只能进行活菌检测。而Xpert检测的靶标为样本中的结核分枝杆菌DNA，无论是死菌还是活菌均可检测，因此其灵敏度高于TB-RNA。在43例涂阴培阳的患者中，TB-RNA检出33例，Xpert比TB-RNA多检出5例，原因可能是部分患者咳痰量不多，并且不同检测项目的痰标本可能是患者在不同时间段留取，存在一定的留样差异。以固体培养及菌种鉴定结果为参考标准，TB-RNA的准确率为84.49%，高于涂片和Xpert。这是因为TB-RNA与结核分枝杆菌固体培养一样，均为活菌检测；而涂片和Xpert无论是死菌还是活菌都能检测，因此与培养结果的一致率较低。此外，TB-RNA和Xpert的阴性预测值高于涂片，表明相比于涂片，TB-RNA和Xpert具有更好的阴性排除效果。

Xpert检测在结核病的诊断中具有优异的诊断效能［16-18］。本研究中，虽然Xpert检测的灵敏度优于TB-RNA，但Xpert检测的靶标是DNA，无法区分死菌和活菌［8］。结核培养则是活菌检测，因此与结核培养结果的一致性一般，且用于结核病疗效监测具有滞后性。文献报道，TB-RNA检测在结核病的疗效监测中有较好的应用效果［19-21］。TB-RNA检测是一种以16S rRNA为靶标的RNA恒温扩增技术。由于RNA在环境中易降解，经过排除样本留存环节的污染RNA后，TB-RNA检测结果阳性可视为样本中存在活菌［8］，并且与结核培养结果高度一致。此外，TB-RNA还能有效地区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，而涂片和培养无法做到这一点。

结核分枝杆菌分离培养一直被视为结核病诊断的“金标准”，但它费时费力，无法为临床提供及时的检验结果［8］，且灵敏度相对较低［22］。活菌检测对于结核病的诊断和治疗疗效评估具有重要意义。本实验结果显示，TB-RNA的检测灵敏度和特异性相较于传统方法具有一定优势，并且使用核酸扩增技术具有检测时效性强等优点。虽然现阶段TB-RNA检测尚不能完全取代结核分枝杆菌分离培养，但它拥有自己的技术特点和优势，可以用于继发性活动性肺结核患者的辅助诊断。

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（收稿日期：2024-07-29 修回日期：2024-11-05）

（编辑：梁明佩）

基金项目：广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目（S2021031）；广西科技重大专项（桂科AA22096027）

第一作者简介：周游，男，副主任技师，研究方向：结核病分子诊断。E-mail：747767911@qq.com

通信作者：杨小兵。E-mail：Yangxb110@sina.com

［本文引用格式］周游，何希，黄丽花，等.痰TB-RNA在继发性活动性肺结核患者中的应用［J］.右江医学，2024，52（12）：1097-1101.