白藜芦醇治疗非小细胞肺癌机制的网络药理学分析及实验验证

董杨逗，钮宇恒，张 羽，霍如婕，刘清华，田新瑞,

（1.山西医科大学基础医学院，山西太原 030001；2.山西医科大学第一临床医学院，山西太原 030001；3.山西医科大学第二医院，山西太原 030000）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌，在所有恶性肿瘤中排名第一[1-2]。依照组织病理学特征，可分为小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）与非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 为肺癌发病率最高的分型之一，占所有肺癌病例的80%～85%[3]。根据组织学类型，NSCLC 主要分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，每种类型的癌细胞通过不同的方式生长和扩散[4]。可用于肺癌的治疗包括手术、放疗、化疗、免疫调节治疗和分子靶向治疗[1]。以化疗为基础的方案仍然是治疗的首选选择。然而，化疗对晚期NSCLC 患者仍然不够有效，5 年生存率仅为15%，中位生存期为10～12 个月[5]。因此，需要进一步探索NSCLC 发生发展的机制，为NSCLC 治疗寻找新的靶点。

白藜芦醇是一种天然的多酚类植物抗毒素，它广泛存在于葡萄皮，葡萄酒，浆果，坚果等物质中[6]。相关研究证实，白藜芦醇具备诸多生理和药理活性，如抗氧化、抗炎、保护心脏和抗癌属性[7]。白藜芦醇的抗癌特性已在几种不同类型的癌症中得到证实，包括乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌等[6-8]。Wang 等[9]发现在NSCLC 原位大鼠模型中，白藜芦醇通过抑制STAT3/HIF-1α/VEGF 通路抑制肿瘤进展。另一项研究报道了白藜芦醇通过调控p53、Bax、Bcl-2 和caspase-3 的表达来抑制人肺腺癌A549 细胞的增殖并诱导凋亡[10]。这些研究为检测白藜芦醇与NSCLC之间的关系提供了线索，但白藜芦醇对肺癌发挥抑制作用的潜在靶点和分子机制仍未完全清楚。

网络药理学是以系统生物学理论为基础，针对特定分子靶标进行药物分子模拟及设计的新兴学科，通过对靶点网络的综合分析，发掘药物作用的潜在信号通路，明确药物疗效的作用机理[11]。分子对接技术是利用计算机高精度对接模拟，基于分子模型模拟配体-靶标相互结合[12]。本研究应用网络药理学方法和分子对接技术进行靶标预测，分析白藜芦醇抑制NSCLC 的可能作用机制，运用临床病例验证及细胞实验进一步评估，提高结果的可靠性。为后续研究及临床应用提供一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肺腺癌A549 细胞 上海细胞库；白藜芦醇（分子质量228.24 g/mol，纯度＞99.99%）、脱脂牛奶粉末 MCE 公司；青-链霉素溶液、0.25%胰酶细胞消化液、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上海碧云天公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 细胞培养基 美国赛默飞公司；PBS 缓冲液、PMSF 蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 生工生物工程公司；预染蛋白Marker、BCA 蛋白定量试剂盒、RIPA 裂解液、5×上样缓冲液（5×loading Buffer）、TBST 缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶快速配置试剂盒（SDS-PAGE）、ECL化学发光液 武汉博士德公司；Anti-GAPDH 抗体、Anti-SRC 抗 体、Anti-EGFR 抗 体、Anti-p-PI3K 抗体、Anti-p-AKT 抗体、HRP 标记羊抗兔IgG 武汉ABclonal 公司。

CKX41 倒置显微镜 日本Olympus 公司；Midi 40 细胞培养箱 美国Thermo Fisher Scientific 公司；Mini-PROTEAN® Tetra Cell 垂直电泳仪、rans-Blot SD 半干电转膜仪、ChemiDoc™ Imaging System WB 全自动化学发光成像仪 上海伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇靶点的筛选 通过数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）得到化合物白藜芦醇化学结构，并保存对应Canonical SMILES 号。此外，通过结合Swiss Target Prediction（swisstargetprediction.ch）和Target net 数据库（targetnet.scbdd.com）得到白藜芦醇的潜在作用靶点。

1.2.2 NSCLC 的靶点筛选 通过数据库Genecards（https://www.genecards.org）和数据库OMIM（https://www.omim.org）以及数据库TTD（db.idrblab.net），对NSCLC 潜在靶点进行筛选。

1.2.3 药物-疾病-靶点网络分析 将数据库预测的白藜芦醇的靶点和NSCLC 的靶点上传到Venny 2.1.0平台（bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny），获取药物的靶点和疾病的靶点交集，绘制白藜芦醇与NSCLC 的交集靶点Venny 图。

1.2.4 PPI 网络构建与分析 将筛选出的白藜芦醇与NSCLC 共有靶点，导入STRING 数据库（https://string-db.org），种属定义为“Homo sapiens”进行分析，构建药物靶蛋白和疾病靶蛋白PPI 网络，其最低阈值取中等 “medium confidence”得到靶蛋白相互作用的核心网络关系。导入Cytoscape 3.7.2 软件包，进一步绘制药物靶蛋白和疾病靶蛋白相互作用网络图。对网络的拓扑参数进行软件分析和计算，得到各个靶点的度值（degree）和介数（betweenness centrality，BC）等，直观显示排名前十名的靶标蛋白[11]。

1.2.5 GO 和KEGG 富集分析 为了解释药物靶点对基因功能的影响，将以上选取的白藜芦醇和NSCLC共有靶点引入Metascape 数据库（https://metascape.org）中，与R 语言结合，获得对应的GO 和KEGG通路富集结果。

1.2.6 分子对接 选取白藜芦醇和NSCLC 互作蛋白PPI 网络中度值排名前三位的关键靶点，实现了白藜芦醇与靶蛋白的分子对接，通过进一步在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）检索获取白藜芦醇的3D 结构式。在PDB 数据库（https://www.rcsb.org）将关键靶点PDB 格式进行下载，EGFR、SRC、ESR1 等靶蛋白PDB 编号分别为6z4b、1o4k 以及2r6y。用Pymol 软件处理去水和配体，保存[6]。利用Autodock Vina 和Pymol 软件将3 个关键靶点与白藜芦醇进行分子对接。

1.2.7 癌症基因组图谱分析临床数据 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库获得NSCLC 病人（样本数为1017 例）和健康人群（样本数为627 例）的临床信息，使用R 软件v4.0.3 对筛选出的八个核心靶基因进行统计分析，两组样本显著性通过Wilcox 检验，P＜0.05被认为具有统计学意义。

1.2.8 细胞培养及干预 将A549 细胞悬液接种于培养皿，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验分为空白对照组和白藜芦醇药物干预组。待细胞处于对数生长期时进行给药处理，空白对照组不做药物处理，药物干预组分别使用浓度为30、50 μmol/L 的白藜芦醇干预。

1.2.9 Western Blot 检测蛋白表达 收集各组细胞加入增强型RIPA 裂解液冰上孵育45 min，将裂解液在12000 g，4 ℃下离心10 min 提取蛋白。蛋白浓度使用BCA 蛋白定量试剂盒检测。将总蛋白与上样缓冲液混合，进行SDS-PAGE 电泳，凝胶常规处理后，将蛋白转移到PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入合适浓度的GAPDH（内参），SRC、EGFR、p-PI3K、p-AKT 一抗4 ℃孵育过夜，与抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体在室温下孵育1 h，孵育后常规洗膜处理，ECL 化学发光显影，使用Bio-Rad 凝胶成像系统观察蛋白表达。Image J 软件对目的条带进行统计分析，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.3 数据处理

数据处理使用GraphPad Prism 8 统计软件分析，数据检测至少重复3 次，以均数 ±标准差（D）表示。组间比较采用方差分析，方差齐性时，用oneway ANOVA 检验，两两比较则用LSD-t检验；方差不齐时，采用Kruskal-Wallis H 检验。P＜0.05 表示有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇药物靶点及非小细胞肺癌疾病靶点的获取

从PubChem 中检索化合物白藜芦醇的Canonical SMILES 号，通过Swiss Target Prediction 数据库和Target net 数据库检索获取到预测靶点一共174个。应用Genecards、OMIM、TTD 这三个数据库进行疾病靶点的筛选，得到652 个NSCLC 相关靶点。

2.2 PPI 网络分析及关键靶点筛选

预测得到的白藜芦醇靶点与NSCLC 相关靶点交集共40 个，如图1 所示。将40 个靶点上传至STRING 数据库，得到靶点之间的PPI 网络，不同颜色的边代表不同类型，边的粗细代表关联分值大小，节点即为靶点，如图2 所示。将度值从大到小排序，前五位的有EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF；介数越大的靶点在药物作用过程中越关键，其排名前5 位的靶点分别为ESR1、MMP9、CDC42、TNF、RELA，如表1 所示。整合度值和介数前5 位的靶点，去除重复，得到以下基因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF、MMP9、CDC42、RELA为主要关键靶点。预测其可能为白藜芦醇作用的关键靶标。

图1 白藜芦醇-非小细胞肺癌疾病靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of resveratrol-NSCLC disease target

图2 白藜芦醇治疗非小细胞肺癌的蛋白互作网络分析图Fig.2 PPI network at intersection targets of resveratrol and NSCLC

表1 白藜芦醇治疗非小细胞肺癌疾病前10 个关键靶点Table 1 Top 10 key targets of resveratrol for non-small cell lung cancer disease

2.3 GO 与KEGG 富集分析

将筛选出的40 个靶标基因于Metascape 数据库做GO 功能分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括三种，分别是生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）以及细胞组分（cellular component，CC）。利用R 语言可视化处理排序在前10 位具有显著性差异的基因富集结果，如图3 所示。BP 研究结果表明交集基因集中于调控细胞凋亡信号通路（regulation of apoptotic signaling pathway）、细胞凋亡信号通路负调节（negative regulation of apoptotic signaling pathway）、激酶活性正调节（positive regulation of kinase activity）等生物过程。CC 的富集结果显示交集基因主要分布在薄膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、局部粘连（focal adhesion）等细胞部位。MF 富集结果表明交集基因参与调控蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、转录辅助因子结合（transcription coactivator binding）等分子功能发挥治疗非小细胞肺癌的作用。

图3 GO 富集分析结果Fig.3 GO enrichment analysis results

在Metascape 数据库进行KEGG 通路富集分析共获得131 条KEGG 条目，取前10 个主要通路进行数据处理后，得到KEGG 通路分析气泡图，纵坐标代表靶标基因主要参与的信号通路，如图4 所示。结果显示，白藜芦醇治疗NSCLC 的相关信号通路有肿瘤蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、内分泌抵抗通路（endocrine resistance）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、人巨细胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection）、PI3K-AKT（PI3K-Akt signaling pathway）等多条信号通路。

图4 KEGG 富集分析结果Fig.4 Results of KEGG enrichment analysis

2.4 分子对接分析

为了进一步评估白藜芦醇与关键靶标之间的结合能力，提高靶标网络的准确性，利用Autodock Vina 对排名前三位核心靶点和白藜芦醇做分子对接分析，对接过程中设置参数，调整X-Y-Z 坐标和网格大小，找到灵活对接的最佳对接条件，并记录受体和配体的对接位置。分子对接结果的分析是指结合能，结合能小于0，说明受体分子与配体分子能自发结合且产生相互作用，结合能越小，说明化合物所需的自由能越少，对接能力越强，对接后分子的稳定性越高[6,11]。对接结果表明，白藜芦醇和三个核心靶蛋白结合自由能均在-5 kcal/mol 以下，表明结合高度稳定，具有对接意义，如表2 所示。最后，使用Pymol软件可视化分析和观察白藜芦醇和靶标的对接结果，结果显示白藜芦醇通过可见的氢键相互作用与其蛋白质靶标结合，靶点的疏水口袋也被白藜芦醇药物所占据，如图5 所示。

图5 前三位核心靶点和白藜芦醇分子对接可视化结果Fig.5 Molecular docking visualization of the top three core targets and resveratrol

表2 对接参数及相应计算结果Table 2 Docking parameters and corresponding calculation results

2.5 核心靶基因在NSCLC 中的表达水平

为探究核心靶基因的表达水平与NSCLS 发生发展的关系，利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库获得基因表达数据以及NSCLC 患者（n=1017）和正常健康人群（n=627）临床数据集，通过筛选、提取并分析靶基因在TCGA 数据库中 NSCLC 患者及健康对照人群中的表达数据，结果表明与健康人群相比，核心 靶 基 因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1以 及MMP9的表达在NSCLC 病人中显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而TNF、CDC42以及RELA的表达相比于健康人群，在NSCLS 病人中显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），如图6 所示。这些发现表明通过网络药理学筛选预测的靶基因与NSCLC 的发生发展密切相关。

图6 NSCLC 患者和健康人群中各靶基因的表达水平Fig.6 Expression levels of each target gene in NSCLC patients and healthy population

2.6 白藜芦醇对A549 细胞蛋白表达的影响

根据网络药理学和临床样本分析的数据，进一步探究白藜芦醇对相关靶基因及信号通路的影响。根据上述结果，在八个核心靶基因中选择排名前两位的EGFR 和SRC 进行初步验证，TCGA 临床样本结果提示EGFR 和SRC 在NSCLC 中具有高表达或高活性的特点，如图6 所示。且有研究表明SRC 可通过与激活的EGFR 起协同作用，参与激活其下游信号通路，从而影响肿瘤细胞的增殖[13-14]。根据KEGG 富集分析，PI3K-AKT 通路具有较强的生物学意义，为进一步分子生物学实验验证提供了方向。因此，使用不同浓度（30、50 μmol/L）的白藜芦醇处理人肺腺癌A549 细胞，利用Western Blot 实验进行初步探究白藜芦醇对靶蛋白EGFR 和SRC 及其下游PI3K/AKT 信号通路蛋白的影响，如图7 所示。WesternBlot 结果显示，与空白对照组相比，白藜芦醇药物干预抑制了A549 细胞中SRC、EGFR、p-PI3K和p-AKT 的活性并以剂量依赖的方式降低了蛋白的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），如图8所示。

图7 白藜芦醇对人肺腺癌A549 细胞的作用假设模型Fig.7 Hypothesis of the effect of resveratrol on human lung adenocarcinoma A549 cells

图8 不同浓度白藜芦醇对人肺腺癌A549 细胞蛋白表达的影响Fig.8 Effect of different concentrations of resveratrol on protein expression in human lung adenocarcinoma A549 cells

3 讨论与结论

本研究共筛选出40 个白藜芦醇治疗NSCLC的作用靶点，并以可视化和交互的模式呈现。通过构建交集靶点的PPI 蛋白互作网络和拓扑学分析，最终获得八个关键靶基因，分别为EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF、MMP9、CDC42、RELA。EGFR属于酪氨酸激酶受体家族，在上皮源性恶性肿瘤中经常过度活跃[15]。靶向EGFR 的受体酪氨酸激酶抑制剂已用于NSCLC 的临床治疗[16]。但仍有TKIs 治疗耐药的出现[17]。因此白藜芦醇有可能为其联合NSCLC 的靶向治疗协同抗肿瘤活性带来新契机。SRC 参与许多细胞信号转导的调控，对肿瘤的生长、转移以及血管生成有着至关重要的作用[18]。在NSCLC 中具有高表达或高活性的特点[19]。研究表明，SRC 可通过与激活的EGFR 起协同作用，参与激活下游信号通路影响肿瘤细胞增殖[13]，也可通过调节G1/S 转化影响细胞周期[20]。ESR1 是雌激素受体的一种亚型[21]，研究表明ESR1 通过与靶基因启动子中的雌激素应答元件和AP-1 增强子元件结合，促进基因转录[22]。此外，ESR1 信号传导也可能与影响T 细胞浸润的肿瘤微环境因素相关[23]。HSP90α是热休克蛋白家族成员[24]，被认为在肺癌的侵袭和迁移调节中起关键作用[25]。TNF 及其受体在NSCLC 中广泛表达[26]，研究表明TNF 可以促进细胞死亡或肿瘤生长[27]。MMP9 是一种基质金属蛋白酶[28]，研究发现MMP9 的表达水平在NSCLC 中显著上调，通过PI3K 信号转导级联抑制EGFR 信号可显著调节NSCLC 的MMP9 的表达[29]。CDC42 已被确定在许多人类癌症中表达异常，包括NSCLC[30]。此外，也有研究报道肿瘤区域RELA 表达与炎症浸润强度相关[31]。

GO 功能富集分析白藜芦醇治疗NSCLC 的相关靶基因，提示白藜芦醇抗癌作用与细胞凋亡有密切关系。已有研究证实了白藜芦醇通过促进细胞凋亡在NSCLC 中的抗肿瘤作用[9]，这与本研究预测结果一致。KEGG 通路富集分析表明白藜芦醇在治疗NSCLC 的过程中主要涉及肿瘤蛋白多糖、雌激素、PI3K-AKT 等多条信号通路。研究发现雌激素途径在NSCLC 发展中的作用是多方面的，一方面，雌激素可易位到细胞核调节基因的转录[32]；另一方面雌激素可以激活SRC 导致下游信号传导的激活，包括RAS/RAF/MEK/ERK 和PI3K/AKT 途径[33-34]。PI3K/AKT 通路调节细胞生长和增殖，在癌症中经常由于突变、扩增、缺失、甲基化和翻译后修饰而失调[35]。在NSCLC 中，PI3K/AKT 信号通路与肿瘤发生进展密切相关[36]。以上富集分析显示了白藜芦醇的潜在靶点分布于多个生物过程及信号通路，这些有效成分协同起到防治NSCLC 的作用，为后续研究提供了思路。

利用TCGA 数据库初步分析临床样本中靶基因的表达与NSCLC 发生发展的关系。结果提示核心靶基因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1以及MMP9的表达在NSCLC 中显著上调，TNF、CDC42以及RELA的表达在NSCLS 中显著下调（P＜0.05）。进一步在细胞水平上探讨白藜芦醇抗NSCLC 的潜在作用机制，由于SRC 的激活参与了癌症的进展且与EGFR 之间存在相互作用，影响着许多下游蛋白，抑制SRC 可能会中断EGFR 的下游信号通路。通过Western Blot 实验，结果提示白藜芦醇抑制了A549细胞中SRC、EGFR、p-PI3K、p-AKT 的活性和蛋白表达，这可能导致癌细胞侵袭和迁移能力的下降。揭示了白藜芦醇发挥其抗癌效应可能是通过抑制NSCLC 中SRC 相关信号通路，包括PI3K/AKT 信号通路。

综上所述，本研究基于网络药理学与实验验证就白藜芦醇治疗NSCLC 的抗癌效应进行了初步探讨，为后续白藜芦醇的基础研究和临床应用提供理论依据和参考价值。