以免疫应答为基础的《医学免疫学》综合实验设计及实践

蔡振明 周泽伟 施冬艳 杨晓帆 张明顺 王慧娟 陈云 卢燕来

作为生命科学和医学领域中一门重要的基础性、前沿性和支柱性学科，《医学免疫学》的学习和研究受到医学生的重视，几乎成为医学院校所有专业学生的必修课之一；同时，医学免疫学与临床医学、预防医学、口腔医学以及生命科学等广泛交叉、相互渗透，为人类疾病的诊断和预防做出了巨大贡献[1-2]。在日常教学过程中，任课教师发现《医学免疫学》课程内容基本概念多、部分内容抽象难懂且相互交错，免疫应答及其调控机制复杂，很多学生在学习过程中难以掌握，学习兴趣降低、积极性差，导致教学效果不甚理想[3-4]。作为一门以实验为基础的学科，实验教学在《医学免疫学》教学中具有非常重要的作用，实验教学不仅能够加深学生对理论知识的理解，还能增强学生的动手能力和科研思维能力，对提升医学免疫学的教学效果具有重要的辅助作用[5-6]。因此，实验教学质量直接关系到学生学习免疫学的效果，但是传统的实验教学模式中教学内容偏陈旧，缺少免疫学新技术、新理论相关的内容，且各实验之间没有明确衔接的联系，呈现“各自为政”的状态。针对这些医学免疫学实验教学过程中存在的不足，文章通过对“以免疫应答为基础的《医学免疫学》综合实验”进行设计及实践，培养学生的实践能力、探索能力和团队合作精神。文章通过对本学系近年来《医学免疫学》实验教学改革的实施情况和成果进行总结和分析，反思该过程中存在的相关问题，以期对后续《医学免疫学》实验课进一步改进，全面提升《医学免疫学》的理论和实验课教学水平。

1 现行《医学免疫学》实验教学存在的问题

目前很多高校的《医学免疫学》实验课存在实验教学内容安排不合理、教学模式僵化、教学内容老旧等不足[7-9]。以南京医科大学为例：临床医学、口腔医学、预防医学等专业本科生《医学免疫学》实验课合计15 学时，3 次实验课安排在3 周完成；实验内容主要包含免疫细胞介导的实验（小吞噬、大吞噬、淋巴细胞转化及E-花环实验的观察）、抗原抗体特异性结合介导的实验（简易酶联免疫吸附实验、胶体金测定HCG），以及补体介导的实验（补体介导的绵羊红细胞溶解实验）。实验课时间安排较分散，各个实验内容间也没有明确的相互联系，且时间安排不够合理，都以5 课时/ 次设置，有的课程时间冗余，课堂节奏拖沓；而另一些实验例如小吞噬等则时间紧张，总体实验设计和安排效率偏低。以上问题导致实验课教学对理论课教学的重要补充与深化作用体现不够明显，也未能充分发挥对提升学生的科研思维能力和解决问题的能力的帮助作用。

2 《医学免疫学》综合实验教学改革的思路

机体内免疫应答是一个连续的过程，从病原微生物（抗原）的入侵开始固有免疫即开始发挥作用（固有免疫细胞的吞噬作用、细胞因子释放、补体激活等），同时固有免疫系统通过抗原提呈、分泌细胞因子等过程激活适应性免疫应答，产生效应性免疫细胞和分子（CD8+T 细胞、辅助性T 细胞、抗体等），最终清除入侵的抗原异物，从而保持机体内环境的稳定与健康[1]。综合实验的改革思路是以机体免疫应答的过程为主线，设计贯穿整个免疫应答过程的相关实验，以提高学生兴趣和动手积极性，促进学生对理论课教学内容的理解，提升学生的科研思维能力。

3 《医学免疫学》综合实验教学改革的具体实施方案

细菌是日常生活中最易接触到的微生物，也是多种感染性疾病的致病源，其中表皮葡萄球菌（包括白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌）是滋生于生物体表皮上的一种革兰氏阳性球菌，属于机会致病菌，在一定条件下，可引起化脓性感染，甚至败血症[10-11]。本实验课程内容设计是围绕白色葡萄球菌进入机体后引发的一系列免疫应答过程展开相关实验，包括细菌进入机体后直接诱发的中性粒细胞对细菌的吞噬（中性粒细胞的吞噬作用）、中性粒细胞增殖（流式细胞术检测小鼠外周血中性粒细胞数量），以及炎性细胞因子释放的检测（酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血肿瘤坏死因子α 含量）3 个相互独立又密切相关的实验。

3.1 中性粒细胞的吞噬作用

血液中的中性粒细胞（neutrophil）具有吞噬异物颗粒的能力，通过趋化、吞噬摄入和杀菌等过程将病原微生物（如化脓性细菌）消化清除，在非特异性免疫中发挥重要作用[12-14]。在体外将中性粒细胞与细菌共同孵育后，中性粒细胞可将细菌吞噬摄入，在显微镜下可见中性粒细胞内被吞噬的细菌。本实验取抗凝小鼠外周血，与白色葡萄球菌体外37℃孵育45 min，模拟白色葡萄球菌入侵早期中性粒细胞对其的吞噬和杀伤作用过程。经涂片和瑞氏染色后，使用显微镜观察中性粒细胞对白色葡萄球菌的吞噬情况，并了解中性粒细胞分叶核等主要形态特征。

3.2 流式细胞术检测小鼠外周血中性粒细胞数量

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的技术。该技术综合利用单克隆抗体、免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等的高新技术，可以在短时间内高速分析上数以万计的细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。目前已经广泛应用在细胞生物学、血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科[15-16]。

当入侵的抗原（细菌）数量较大时，机体内吞噬细胞（例如中性粒细胞）的数量不足以及时有效清除，机体会动员或产生更多的吞噬细胞通过血流到达感染部位，以尽快清除入侵抗原。本实验用白色葡萄球菌腹腔免疫小鼠，16 h 后取小鼠外周血（抗凝），通过流式细胞术检测中性粒细胞（CD11b+Ly-6G+）在外周血单个核细胞中所占比例，反映细菌感染后小鼠体内中性粒细胞的数量变化和发生时相。

3.3 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测小鼠外周血肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量

酶联免疫吸附试验是经典的免疫学实验方法，其原理是将抗原或抗体结合到固相载体上，并用酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记的一抗或二抗来检测特异性抗原或特异性抗体的方法，该技术将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色的变化来判断实验结果，或经酶标测定仪做定量分析，以反映待测抗原或抗体的含量[16]。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种重要的炎性细胞因子，参与多种免疫性炎症的发生和发展过程[17-18]。本实验用白色葡萄球菌腹腔免疫小鼠，16 h 后取小鼠外周血，分离获取血清后通过酶联免疫吸附试验法中的双抗体夹心法检测小鼠外周血中TNF-α 的含量，反映小鼠体内的抗感染炎症反应水平。

4 《医学免疫学》综合实验教学改革的效果

4.1 综合实验教学改革后的教学效果

通过与学生的课堂交流和课后问卷调查发现，大多数学生对于本实验课内容设置表现出极大兴趣和肯定，普遍认为改革后的综合实验教学模式更有助于他们对机体免疫应答过程的理解，并能够培养团队协作能力，同时锻炼了他们的实验操作和实验数据分析能力，对将来的学习和工作都有一定的帮助作用，并有助于提高他们的科研思维能力，见表1。

表1 现行《医学免疫学》实验与《医学免疫学》综合实验比较

4.2 学生实验结果

4.2.1 中性粒细胞的吞噬作用

与白色葡萄球菌共同孵育后的小鼠外周血制作的血涂片经瑞氏染色后，学生在显微镜油镜下可观察到具有典型分叶核的中性粒细胞，同时在其胞质内可见被中性粒细胞吞噬的白色葡萄球菌，见图1 A。

4.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血中性粒细胞含量

对照组小鼠和白色葡萄球菌腹腔免疫小鼠外周血经荧光抗体（anti-CD11b APC、anti-Ly-6G FITC）染色后经流式细胞仪检测，学生发现免疫后小鼠外周血中性粒细胞（CD11b+Ly-6G+）占外周血单个核细胞比例高于对照组小鼠（P＜0.001），见图1 B、C。

4.2.3 酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血TNF-α 含量

通过酶联免疫吸附试验法检测对照组小鼠和白色葡萄球菌腹腔免疫小鼠6 h 后血清中TNF-α 的含量，学生发现免疫后小鼠血清中TNF-α 的含量高于对照组小鼠（P＜0.001），见图1 D。这些结果表明白色葡萄球菌腹腔免疫小鼠后可以增加小鼠外周血中中性粒细胞的百分比，同时增加小鼠体内炎性细胞因子TNF-α 的分泌增多，炎性反应水平增高。

5 讨论

为了解决《医学免疫学》实验教学存在的实验教学内容安排不合理、教学模式僵化、教学内容老旧等问题，进一步提高实验课的教学效果，拓宽学生思维模式，各兄弟院校也提出了很多改革方法和措施。例如，锦州医科大学陈思瑶[19]提出以学生发展为中心的医学免疫学教学改革；南开大学医学院张园等[20]将积累的科研经验整合到医学免疫学教学实验中，设计出“流式细胞仪检测小鼠脾细胞分型及亚型”的综合免疫学实验，获得学生的好评和欢迎；东南大学医学院吴优等[21]以临床或科研具体问题为导向，引导学生寻找解决问题的方法，提高学生对实验课兴趣，同时培养学生科研思维，树立科研理念；北京理工大学生命学院王睿等[22]通过分阶段引导学生完成小组科研报告作业，启发学生针对重大医学问题提出创新想法，从而提升深度分析、大胆质疑、团队协作等科研能力，培养严谨求实、挑战创新等科学精神；川北医学院潘万龙等[23]探索了利用现代网络技术建构的实验教学模式，如通过声音、图形、影像等感官多维度刺激学生的实验课教学方式；南京中医药大学李祺瑞等[24]通过延伸现有实验项目使其逐步贴近实践、加重实验课内容考核比重并将生物安全意识纳入实验课考核范围，通过网络和多媒体手段与学生实时沟通帮助学生进行课前预习和课后思考等一系列措施实现实验课程的优化改革；海军军医大学李天亮等[25]将科研讨论融入免疫学教学，提高了学生的学习兴趣和自主学习的能力，帮助学生更好地理解医学免疫学的基础理论知识，既有效提高了教学水平，也有利于学生初步形成科研思维；青岛大学基础医学院任书荣等[26]采用以问题为中心的综合性实验教学模式，激发学生的兴趣和参与热情，提高了医学免疫学教学质量；空军军医大学孙元杰等[27]建立了前导式、贯穿式、科研式相结合为特点的实验教学新模式新方法，并且以多样的教学手段，全程的过程培养，调查问卷等方式检验教学效果，提升了免疫学课程的整体教学质量。这些改革措施都取得了不错的教学效果，但仍缺乏贯穿机体免疫应答过程的相关实验教学方案。

近年来，南京医科大学基础医学院免疫学系也对沿用了多年的实验教学内容进行了整体调整，陆续新增了小鼠免疫组织和器官的观察、补体依赖的细胞毒作用、胶体金免疫层析检测HCG 等内容[28-29]；但仍存在实验课上课时间分散、各个实验内容之间缺乏联系等问题。为此，在总结前期实验教学改革经验的基础上，本校设计了基于免疫应答过程的综合实验教学模式：围绕病原体（白色葡萄球菌）入侵后机体免疫应答的过程，设计相关的实验方案，通过该综合实验综合培养学生实践能力、探索能力和团队合作精神。经过2 年来的教学实践，笔者发现综合实验课的课堂教学效果更好，学生反馈更积极，他们认为此次实验课不仅能锻炼自己的实验操作和实验数据分析能力，还有助于提高自己的科研思维能力。但是，在实践过程中也发现一些问题：首先，本实验需要连续2 d 的时间来完成，学生实验课程的时间安排需要重新调整；其次，相较于以往的实验内容，综合实验的实施需要耗费较多的人力和物力，这可能导致综合实验的大规模推广受到一定限制；再者，改革后的综合实验课程能够全面提高学生的实验操作技能、统计和分析实验结果的能力，以及团队协作的能力，但现行的考核评价体系还不能完全体现，需要尽快建立动态的、对个人综合能力更合理的评价方式。

综上所述，本次《医学免疫学》综合实验教学的改革以机体抗感染免疫应答的过程为主线，设计贯穿病原体入侵机体后诱发的早期免疫应答过程的实验内容，可以进一步促进学生对理论课教学内容的理解。改革后的综合实验课程使学生的实验操作技巧、对实验结果的统计和解析能力以及团队协作能力得到了全面的提升，同时塑造学生的科研思维能力，对培养适应新时代需要的医学生具有重要的促进作用。