糠椴木聚糖提取及纳米木聚糖制备工艺优化

李慧杰,孙金龙,张鸣远,王宏兴,葛泽儒,庞久寅,夏富才

(1.吉林省木质材料科学与工程重点实验室(北华大学),吉林 吉林 132013;2.梅河口市山城镇综合行政执法队,吉林 梅河口 135022;3.长春净月经济开发区应急管理局,吉林 长春 130000)

糠椴(Tiliaamurensis)隶属椴树科(Tiliaceae),主要生长在湿润的山区和温暖湿润的平原地带。由于具有显著的生态和经济价值,糠椴被认为是一种可持续资源和环保原料[1]。木聚糖为普遍存在的半纤维素,是由β-1,4-糖苷键连接的多糖单元组成的能够自然生物降解的大分子物质[2-3],在环保方面展现出重大的应用价值[4-5]。木聚糖存在于植物细胞的半纤维素组分中,具有绿色环保、有效抑制微生物、无刺激性和可生物降解等特性,展现出了优异的抗菌性能[6]。

为高效开发与利用糠椴资源,本文采用碱提法提取木聚糖。碱提法是一种常用的木聚糖提取方法,能从糠椴中有效提取高纯度木聚糖,可为后续研究和应用奠定基础。纳米木聚糖是对木聚糖进行纳米级修饰后的产物,能充分发挥木聚糖的固有优势[7-8],主要体现在显著增强机械性能,如抗拉强度、韧性和耐久性等,这些特性的显著提升极大拓展了纳米木聚糖在多种材料中的应用。纳米木聚糖具有良好的生物降解和环保特性[9-10],在多种材料生产过程中,采用纳米木聚糖可以显著降低与传统塑料等不可生物降解材料相关的环境影响[11-12]。此外,相较于未经修饰的木聚糖,纳米木聚糖显示出优异的热稳定性,特别适用于需要高耐热性材料的应用场景,如电子和汽车行业[13]。纳米木聚糖以其独特的性质和优势,已经成为被广泛应用的多功能材料[14]。本文通过碱提法从糠椴中提取木聚糖,通过二次碱液处理制备纳米木聚糖,并采用响应面法(RSM)[15-16]优化纳米木聚糖制备工艺[17],可为糠椴资源开发提供参考与支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

糠椴茎、叶,市场购买;木糖(化学纯),二乙醇胺、氢氧化钠(分析纯),上海百灵威化学技术有限公司;无水乙醇(工业级),3,5-二硝基水杨酸(化学纯),无水乙醇、乙酸乙酯、无水甲醇(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;酒石酸钾钠、苯酚、盐酸、硫酸、亚硫酸钠、戊二醛,分析纯,上海阿拉丁生物科技股份有限公司;马来酸酐,分析纯,济南创科化学有限公司;对甲苯磺酸,分析纯,上海源叶生物科技有限公司;3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵,分析纯,上海易恩化学技术有限公司。

1.2 试验设备

电热恒温水浴锅(HH-1),金坛市富华仪器有限公司;数显多头磁力加热搅拌器(HJ-6A),常州市亿能实验仪器有限公司;分析天平(TG328A),上海天平仪器厂;电子万用炉(DK-98-Ⅱ),天津市泰斯特仪器有限公司;高速离心机(HC-3514),安徽中科中佳科学仪器有限公司;高速多功能粉碎机(HL-FS400),上海寰熙医疗器械有限公司;电热鼓风干燥箱(DL102),天津市实验仪器厂;真空冷冻干燥机(BK-FD12T),山东博科生物产业有限公司;纳米激光粒度仪(Winner802),济南微纳仪器股份有限公司;电子显微镜(TM3030 plus),日本日立高新技术公司。

1.3 糠椴木聚糖提取

选择无变质糠椴,放入高速多功能粉碎机粉碎后用80目筛筛选,得到糠椴粉末。将糠椴粉末在索氏提取器中用95%乙醇溶液抽提12 h,除去蜡质,然后用去离子水洗涤,置于40 ℃电热鼓风干燥箱中,干燥后取出。取糠椴粉末10 g放入烧杯中,加入150 mL 10%NaOH溶液,在90 ℃下浸提3 h,经过抽滤得到提取液,调节pH为5,将3倍体积的乙醇加到剩余液体中进行醇沉,将得到溶液放在4 ℃冰箱中12 h。滤去多余液体后,用高速离心机在8 000 r/min下离心10 min,重复3次,将得到的物质放入真空冷冻干燥机中冻干。

1.4 木糖标准曲线绘制

分别将0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL木糖标准溶液加到25 mL比色管中,加水至1.0 mL,再加入3 mL的3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液。在沸水浴下蒸煮5 min,冷却至室温,加水定容,摇匀,在520 nm处测定木糖溶液吸光度。以不含木糖的溶液作为对照,利用木糖的质量浓度绘制吸光度曲线,最终确定木糖标准曲线。

1.5 木聚糖得率测定

取一定量的木聚糖溶液,调pH至5.5,加入3倍体积的乙醇进行醇沉,置于4 ℃冰箱中过夜,然后在高速离心机5 000 r/min下离心10 min,从离心管中滤去上清液,取其沉淀,加入一定量的0.1 mol/L HCl,于90 ℃水解2 h,中和、定容、过滤,测定滤液的还原糖质量,乘以木聚糖聚合因数0.9作为木聚糖质量,采用DNS法测定还原糖。木聚糖得率(%)=(m1/m2)×100%,式中:m1为提取的木聚糖质量(g);m2为原料质量(g)。

1.6 纳米糠椴木聚糖制备

取1 g冻干的糠椴多糖粉末,加入200 mL的5%氢氧化钠溶液中,在70 ℃下溶解,冷却至室温,使用稀盐酸将pH调至5.5,倒入3倍体积的无水乙醇进行醇沉。将沉淀物在索氏提取器中抽提1.5 h,抽提后,在真空冷冻干燥机冷冻干燥24 h,机械研磨得到淡黄色粉末,即为纳米糠椴木聚糖。

1.7 粒径测定

将制备的纳米木聚糖在蒸馏水中充分溶解,超声分散,利用纳米激光粒度仪测定纳米木聚糖粒径。

1.8 响应面法优化工艺

依据中心组合试验设计原则,将纳米木聚糖粒径作为指标设计3因素3水平响应面分析试验,因素水平见表1。利用Design Expert 8.6软件建立的二项式模型分析数据,确定纳米木聚糖最佳制备工艺参数。

表1 Box-Behnken 设计因素及水平

1.9 透射电镜分析

利用HT7800型透射电子显微镜(TEM,加速电压200 kV)对纳米木聚糖粒子形态进行观测。取1滴分散在无水乙醇中的纳米木聚糖溶液滴置于铺有碳膜的铜网上,在溶剂挥发后进行表征。

2 结果与分析

2.1 木糖标准曲线

通过分光光度法测定木糖标准样品在520 nm波长的吸光度,根据已知木聚糖标准样品的质量浓度(x)和对应的吸光度(y)绘制标准曲线。建立的回归方程为y=0.904 6x+0.004 5,线性相关系数R2=0.997 1,见图1。

图1 木聚糖质量浓度与吸光度的回归线性方程Fig.1 Regression linear equation of xylan mass concentration and absorbance

2.2 不同条件对木聚糖得率的影响

2.2.1 碱液质量分数对木聚糖得率的影响

碱液质量分数对木聚糖得率的影响见图2。由图2可见:当碱液质量分数为10%时,木聚糖的得率最高;当碱液质量分数超过10%时,大部分木聚糖会随着碱液质量分数的提高而逐渐水解,可能是因为碱液可以溶解植物细胞壁中的木聚糖,过高的碱液质量分数会使木聚糖发生碱解,断裂β-1,4糖苷键,导致木聚糖链降解转化为低聚木糖和单糖,从而降低了提取率。因此,从糠椴中提取木聚糖的最佳碱液质量分数为10%。

2.2.2 固液比对木聚糖得率的影响

固液比对木聚糖得率的影响见图3。由图3可见:当固液比(g/mL)由1∶5增加到1∶15时,木聚糖得率大幅上升;当固液比继续增加到1∶20时,得率仅仅提高了0.76%。当固液比大于1∶15后,得率随固液比提高的上升趋势并不明显,可能是当固液比为1∶15时,木聚糖在提取液中的溶解度已接近饱和。适量溶剂可以充分溶解和提取木聚糖,但过多的溶剂会导致溶液中的木聚糖浓度过低,从而降低了木聚糖从植物细胞壁向溶液内部扩散的浓度梯度,提取率下降。

图2 碱液质量分数对木聚糖得率的影响Fig.2 Effect of alkali concentration on the yield of xylan图3 固液比对木聚糖得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of xylan

2.2.3 处理温度对木聚糖得率的影响

处理温度对木聚糖得率的影响见图4。由图4可见:当处理温度为90 ℃时,木聚糖的得率最高,为42.65%。反应温度继续提高,木聚糖得率大幅下降,这可能是因为木聚糖的稳定性会随着温度升高而降低,当温度持续上升时,多糖结构受到破坏,木聚糖链发生裂解,产生了大量的低聚糖、寡糖和单糖,导致木聚糖得率下降。因此,最佳处理温度为90 ℃。

2.2.4 处理时间对木聚糖得率的影响

处理时间对木聚糖得率的影响见图5。由图5可见:处理时间在60～120 min时,随着处理时间的增加木聚糖的得率显著提高;超过120 min后有小幅降低,这是因为当达到饱和状态后,过长时间的处理会导致溶液中的木聚糖链发生降解,产生低聚物,导致木聚糖得率下降。当处理时间为120 min 时,木聚糖得率最大。因此,处理时间应选择120 min。

图4 处理温度对木聚糖得率的影响Fig.4 Effect of treatment temperature on yield of xylan图5 处理时间对木聚糖得率的影响Fig.5 Effect of processing time on extraction yield of xylan

2.3 各因素对纳米木聚糖粒径的影响

2.3.1 碱液质量分数对纳米木聚糖粒径的影响

碱液质量分数对纳米木聚糖粒径的影响见图6。由图6可见:随着碱液质量分数的提高,纳米木聚糖的粒径呈现下降趋势,当碱液质量分数超过3%时,纳米木聚糖的粒径呈现大幅上升趋势,这可能是因为碱液在木聚糖粒子纳米化的过程中发挥着催化剂作用,当碱液质量分数较低时,随着碱液质量分数的提高,对木聚糖粒子向纳米木聚糖粒子的分解和转化起着促进作用;但当碱液质量分数过高时,会破坏木聚糖的长链结构,产生小分子物质,大部分木聚糖粒子在纳米化的过程中受到阻碍,从而抑制了木聚糖粒子的分解速率。

2.3.2 处理温度对纳米木聚糖粒径的影响

处理温度对纳米木聚糖粒径的影响见图7。由图7可见:随着处理温度的提高,纳米木聚糖的粒径减小,当处理温度为60 ℃时,粒径为9.56 nm,达到最小值;当处理温度超过60 ℃时,纳米木聚糖的粒径增大。这可能是因为当温度较低时,随着温度的升高,提高了大分子木聚糖粒子的反应活性,从而促进了大分子木聚糖粒子向小分子纳米木聚糖粒子的转化;当温度过高时,纳米木聚糖粒子在纳米化的过程中表面能升高(吸收了大量热能),为了降低表面能,大量新生的纳米木聚糖粒子会发生团聚现象而达到稳定状态。因此,当温度过高时,纳米木聚糖的粒径反而出现上升的情况。

图6 碱液质量分数对纳米木聚糖粒径的影响Fig.6 Effect of alkali concentration on theparticle size of nanoscale xylan图7 处理温度对纳米木聚糖粒径的影响Fig.7 Effect of treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

2.3.3 处理时间对纳米木聚糖粒径的影响

处理时间对纳米木聚糖粒径的影响见图8。由图8可见:随着处理时间的增加,纳米木聚糖的粒径呈现变小的趋势。但当处理时间超过2 h时,纳米木聚糖的粒径反而会大幅增加,这可能是因为当处理时间较短时,木聚糖粒子活性较小,分解和转化速率很慢;当处理时间增加时,木聚糖粒子逐渐纳米化,粒径达到最小,但如果处理时间过长,大量粒子会出现团聚现象,从而引起纳米木聚糖的粒径大幅上升[18]。

图8 处理时间对纳米木聚糖粒径的影响Fig.8 Effect of processing time on the particle size of nanoscale xylan

2.4 响应面法优化糠椴纳米木聚糖的提取工艺参数

2.4.1 试验结果及方差分析

通过Design-Expert 8.6软件进行数据回归分析,得到二次回归方程:y=9.63+0.11A+2.84B-2.55C+0.057AB+0.31AC+0.8BC+9.44A2+11.53B2+19.49C2.Box-Behnken 试验结果见表2,回归模型方差分析见表3。表1给出了响应面试验因素设计;表2为根据表1参数设计记录的17次试验结果,为建模和优化提供了数据基础;表3验证了所建立的回归模型具有良好的拟合效果和显著性,可用于优化确定最优条件。

表2 Box-Behnken 试验结果

表3 回归模型方差分析

2.4.2 响应面分析

碱液质量分数和处理温度对纳米木聚糖粒径的影响见图9,处理温度和处理时间对纳米木聚糖粒径的影响见图10。由图9、10对比可见,图10建立的3D响应面倾斜度最高,等高线颜色变深,说明处理时间和处理温度的交互作用最为显著,其他因素的主效应不明显。

图9 碱液质量分数和处理温度对纳米木聚糖粒径的影响Fig.9 Effect of alkali concentration and treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

图10 处理温度和处理时间对纳米木聚糖粒径的影响Fig.10 Effect of treatment temperature and processing time on particle size of nanoscale xylan

为了进一步验证不同因素对响应值影响的统计学意义,我们对回归方程系数进行了显著性检验[19],结果见表4。表4检验结果也显示处理温度B和处理时间C及其交互项BC对粒径影响达极显著水平(P<0.000 1),而碱液质量分数A和其交互项AB、AC的影响不显著(P>0.05),这与响应面分析结果一致,表明处理温度和时间是决定纳米木聚糖粒径的主效应因素。为确定响应面模型的最优点,分析建立的回归方程数据,结果表明:当处理温度为58.74 ℃、处理时间为3.03 h、碱液质量分数为3%时,纳米木聚糖粒径最小,为9.36 nm。

表4 回归方程系数显著性检验

为了检验试验的可靠性,在最佳制备条件下制备纳米木聚糖。同时,考虑到实际操作的方便性,将最佳制备条件调整为处理温度59 ℃,处理时间2 h,碱液质量分数3%,在此处理条件下,纳米木聚糖的粒径为9.36 nm。如图11所示(绿色代表通过率,红色代表粒径占比),在此优化条件下经过多次试验验证得到的纳米木聚糖粒径为9.58 nm,与纳米木聚糖粒径的理论值9.36 nm相比,相对误差为2.2%。由此表明,试验结果与模型预测吻合度较高,验证了响应面法求解最优点的准确性,也表明优化后的工艺条件能够较好地控制产品粒径,获得粒径较小、分布较均匀的纳米木聚糖产品。因此,采用响应面法优化纳米木聚糖最佳制备条件参数准确、可靠,具有非常高的实用价值[20]。

图11 纳米木聚糖粒径Fig.11 Nanometer xylan particle size

2.5 透射电镜分析

为了进一步验证纳米木聚糖的粒径,使用透射电子显微镜观察纳米木聚糖的形态,并测量粒子大小,见图12。图12 a、b、c分别为纳米木聚糖在500、200、200 nm下的透射电镜图像。

图12 纳米木聚糖TEM图Fig.12 TEM image of nano xylan

由图12可见:纳米木聚糖粒子接近于圆状的且形状较规则;粒径在20～40 nm,这一结果与粒径测定结果相符;纳米木聚糖粒子聚集在一起,这是因为表面能高,纳米木聚糖发生了团聚现象。

3 结 论

采用响应面法对糠椴木聚糖的碱法提取与纳米木聚糖制备工艺进行了优化。通过试验确定了糠椴木聚糖最佳提取工艺参数,即以糠椴为原料,碱液质量分数为10%,处理温度为90 ℃,处理时间为3 h,固液比为1∶15(g/mL),在此条件下,能够有效地从糠椴中提取出木聚糖;纳米木聚糖的最佳制备工艺参数为处理温度59 ℃,处理时间2 h,碱液质量分数5%,在此条件下得到的纳米木聚糖粒径为9.36 nm;通过透射电子显微镜观察发现,纳米木聚糖呈现出接近于圆形的形态,形状规则,粒径基本在20～40 nm,这个结果与纳米激光粒度仪的粒径测试结果相符合,证实了按照上述工艺制备的纳米木聚糖的质量和粒径。

本研究验证了响应面法在工艺参数优化中的有效性,同时为从糠椴中提取木聚糖、制备纳米木聚糖并确认其粒径提供了一种有效方法,具有一定的理论价值和应用价值。