6种武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物差异分析

李 行, 吴李玲, 裴荣红, 朱 琳, 郑福平,*,孙金沅, 李 凡, 李 义, 孙宝国

(1.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室/中国轻工业酿酒分子工程重点实验室, 北京 100048;2.中粮生化能源(肇东)有限公司, 黑龙江 绥化 152001;3.玉米深加工国家工程研究中心 吉林中粮生化有限公司, 吉林 长春 130033)

白酒是世界六大蒸馏酒之一,是中国的国酒,在中国传统文化中占有独特的地位。白酒以高粱与大麦、玉米、小麦等或仅以高粱为原料,以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂,经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成[1]。2021年,中国白酒行业规模以上企业产量716万kL,销售收入6 033亿元,累计增长18.6%,利润1 702亿元。在酿酒产业中,白酒以13.2%市场份额占据整个饮料酒69.5%销售收入和87.3%的利润。

酱香型白酒是中国蒸馏酒的重要香型之一,是采用独特的“四高两长”工艺酿造而成。“四高两长”即高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒和生产周期长、贮存时间长[2]。酱香型白酒的典型风味特征是有优雅的酱香气味,空杯留香,幽雅而持久,入口醇甜、绵柔,具有明显的酸味,口味细腻,回味悠长,深受广大消费者的喜爱。武陵酒是中国酱香型白酒三大代表之一,一度与茅台、郎酒并列;因其产地在湖南省常德市,常德古称武陵,故因地得名;其生产工艺遵循酱香型白酒的典型工艺特点:以糯红高粱为原料,用小麦制高温曲,以石壁泥底窖作发酵池,1年为1个生产周期,全年分2次投粮,9次蒸煮,历经下沙,糙沙,8轮次发酵,7次取酒。酒体有“酱香突出、略带焦香、入口绵甜、幽雅细腻”的风格特点。1989年第5届全国评酒会上,武陵酒获得中国国家名酒称号[3-5]。

挥发性含硫化合物具有气味阈值极低的特点,对各种食品的整体香气有重要影响[6]。尽管它们以痕量水平出现,但其浓度经常超过其气味阈值,因此会给食物带来独特的味道。不同的含硫化合物呈现出不同的典型风味特征,即使在低浓度时,挥发性含硫化合物对酒精饮料的整体风味也具有显著影响,如红葡萄酒中的二甲基硫醚,能够赋予葡萄酒圆润的口感,散发出果香与花香[6];老白干白酒中的苄硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇,浓度仅有(4.87±0.27)μg/L和(0.77±0.02)μg/L,对白酒的烤香具有重大影响[7]。因此,研究挥发性含硫化合物具有非常重要的意义,可帮助调控白酒的生产过程,提高白酒产品质量[8]。

然而大多数挥发性含硫化合物在食品中的浓度低于气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析技术的检出限,难于被鉴定和识别[9-11]。因此,使用专一的硫元素检测器是十分必要的。Song等[7]比较了全二维气相色谱-硫化学发光检测器(comprehensive two-dimensional gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector, GC×GC-SCD)、气相色谱-氢火焰离子检测器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)、GC-MS、气相色谱-火焰光度检测器(gas chromatography-flame photometric detector, GC-FPD)和气相色谱-硫化学发光检测器(gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector, GC-SCD)分析技术的灵敏度。结果表明,GC×GC-SCD的灵敏度至少比GC-FID、GC-MS、GC-FPD和GC-SCD分别高出2 769、2 350、985和11倍。硫化学发光检测器(sulfur chemiluminescence detector,SCD)是目前公认检测硫元素最灵敏、选择性最强的检测器,利用其选择性高、分辨率高、灵敏度高、线性范围宽的优点,可以解决白酒中含硫化合物难以准确检测的难题,完善白酒风味物质研究的理论基础。

本研究以6种不同类型武陵酱香型白酒为研究对象,采用顶空固相微萃取(head space solid phase micro-extraction,HS-SPME)结合GC×GC-SCD分析技术,对挥发性含硫化合物进行定性和定量分析。依据定量分析结果,采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析法,研究6种不同类型武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物的差异,探寻主要特征含硫化合物的组成。希望本研究可为酱香型白酒的调配提供数据参考,为白酒企业调控生产过程、提高产品质量提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6种不同类型的武陵白酒(SJ1、SJ2、WJ、YJ、ZJ、LJ),湖南武陵酒有限公司;由不同年份、不同轮次的原浆酒调制而成,样品于冰箱中4 ℃保存,直至分析,样品相关信息见表1。

表1 6种武陵酱香型白酒样品信息

超纯水由GenPure UV-TOC Xcad plus超纯水仪制得,并煮沸冷却至室温。

烯丙硫醇、正丁硫醇、3-甲基-2-丁硫醇、噻吩、硫代乙酸甲酯、甲硫醇、硫代乙酸乙酯、2-甲基噻吩、硫代丁酸甲酯、二乙基二硫醚、噻唑、烯丙基甲基二硫醚、2-甲氧基噻唑、4,5-二甲基噻唑、二甲基三硫醚、甲硫基乙酸乙酯、2-甲基四氢噻吩-3-酮、3-甲硫基丙酸乙酯、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、3-噻吩甲醛、1,3-二噻烷、2-噻吩甲醛、硫代乙酸糠酯、2-噻吩羧酸乙酯、甲基糠基二硫醚、硫代糠酸甲酯、苯并噻唑,色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;氯化钠,分析纯,北京百灵威科技有限公司;乙醇,色谱纯,上海阿拉丁试剂公司。

1.2 仪器与设备

GC×GC-SCD,美国力可公司(配备Agilent 7890B型气相色谱仪,美国Agilent公司;SCD355型硫化学发光检测器,美国力可公司;Pegasus Ⅲ型四喷口液氮型调制器,美国力可公司);DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,河南予华仪器有限责任公司;VORTEX2型涡旋仪,德国IKA公司;75 μm CAR/PDMS型萃取头,美国Supelco公司;固相微萃取手动进样器,美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1挥发性含硫化合物的萃取

参照课题组前期工作经验,采用HS-SPME富集白酒中的挥发性含硫化合物[7]。将不同样品用超纯水稀释至乙醇体积分数为10%;取15 mL稀释后的酒样置于40 mL顶空进样瓶中,加入4.3 g氯化钠,并加入搅拌子,用封口膜密封。

平衡和萃取温度均为30 ℃,平衡30 min,萃取30 min,搅拌速度为400 r/min。然后,将SPME萃取头立即插入GC×GC-SCD的进样口,解析5 min。萃取头在使用前在气相色谱进样口于250 ℃老化10 min。每组实验均进行3次平行实验。

1.3.2挥发性含硫化合物的检测

采用GC×GC-SCD分析白酒中的挥发性含硫化合物。

GC×GC系统。第一维柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二维柱为DB-5(2 m×0.25 mm×0.1 μm),2根色谱柱以串联方式连接。载气为He,纯度99.999%,流速1 mL/min;进样口温度250 ℃,压力207 kPa,手动进样,不分流;第一维柱温箱升温程序为初始温度50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至150 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;第二维柱温箱升温程序中各阶段温度均高于第一维柱温箱 5 ℃。调制器温度高于第一维柱温箱15 ℃,调制周期5 s,热吹时间0.7 s,冷吹时间1.8 s,液氮制冷。

SCD系统。检测器温度为250 ℃,双等离子体控制器温度为800 ℃,氢气流速为45 mL/min,空气流速为60 mL/min,臭氧压力为0.03 MPa,SCD的采集速率设置为50 Hz。

1.3.3挥发性含硫化合物的定性和定量

采用外标曲线法对目标化合物进行定量。以色谱级乙醇为溶剂制备含有23种目标化合物标准品的母液。在顶空进样瓶中加入13.5 mL超纯水,并加入不同体积的标准品乙醇母液,加入乙醇补充至15 mL,从而制备出不同浓度的混标样品。加入4.3 g 氯化钠备用。分析条件同1.3.2节。

采用标准品保留时间比对和自建谱库进行定性分析,并用外标曲线法进行定量,根据标准化合物的峰体积和其浓度的响应比来绘制标准曲线。

1.4 数据处理

所有实验重复操作3次,计算平均值和标准偏差。以SJ1-1、SJ1-2、SJ1-3分别表示SJ1样品的3次平行实验结果,其他组编号与其相似。数据用LECO Chroma TOF Pegasus 4D处理。该软件根据组分的保留时间与各自的标准化合物比较,生成了包含保留时间、峰体积、信噪比(signal/noise,S/N)和体积百分比的数据表,并排除S/N<3的化合物。定性条件为一维保留时间偏差在30 s内,二维保留时间偏差在0.1 s内。采用Graphpad prism软件进行方差分析,应用TBtools软件绘制热图。使用SIMCA 14.0进行PCA和OPLS-DA分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性含硫化合物的定性和定量分析结果

6种武陵酱香型白酒中含硫化合物的二维气相色谱图见图1。由图1可知,不同样品中的挥发性含硫化合物在种类和含量上均存在差异。GC×GC-SCD对含硫化合物检测灵敏度非常高,因此在二维分离上浓度较大含硫化合物拖尾严重,但对痕量含硫化合物检测效果非常好。图1纵坐标为第二维色谱柱的保留时间,横坐标为第一维色谱柱的保留时间。SCD仅对含硫化合物进行响应,图中的颜色代表峰体积大小,颜色从蓝色向红色逐步递进,颜色越红代表该含硫化合物的峰体积越大。由于硫化学发光检测器是将含硫化合物燃烧转化形成激发态SO2再衰变至基态,发出特征的蓝色光谱(280～420 nm),光波通过滤光片后被光电倍增管接收,从而实现对硫的检测。挥发性含硫化合物在SCD燃烧过程所发生的化学反应见式(1)、(2)、(3)。

(1)

图1 6种武陵酱香型白酒全二维气相色谱-硫化学发光检测器检测图谱Fig.1 Comprehensive two-dimensional gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector spectra of 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

(2)

(3)

由图1可知,6种武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物存在显著差异。不同样品中挥发性含硫化合物的差异主要表现在峰的位置、数量、强度及时间上。根据挥发性物质在全二维气相色谱的保留时间,与自建的GC×GC-SCD数据库进行匹配从而对6种白酒中的挥发性含硫化合物进行分析,共检出29种挥发性含硫化合物,结果见表2。编号为28和29的2种含硫组分,由于其保留时间在一维和二维时间上相近,未能准确定性。故研究共准确定性鉴定出27种含硫化合物,主要包括4种硫醇、6种硫酯、5种多硫醚、5种噻唑、6种噻吩和1种噻烷。其中,共有含硫化合物19种,非共有含硫化合物8种。

表2 6种武陵酱香型白酒挥发性含硫化合物的组成

未能准确定性出编号为28和29的2种含硫组分体现出了GC×GC-SCD方法的不足。虽然GC×GC-SCD在检测分析白酒中的含硫化合物时具有很高的灵敏度和选择性,但所产生的信息除了色谱保留时间之外没有提供化合物鉴定的其他详细信息。因此,在后续工作中可与其他色谱技术共同应用于白酒含硫化合物风味物质分析。

选取HS-SPME结合GC×GC-SCD的分析手段,采用外标曲线的定量方法对信噪比大于100的23种含硫化合物进行定量分析,定量分析结果见表2。23种含硫化合物的外标定量的线性方程、相关系数、线性范围见表3。

表3 23种挥发性含硫化合物的外标定量的线性方程、系数和线性范围

不同种类的含硫化合物具有不同的风味特征。如硫醚类多有蒜香味;二烯丙基二硫醚,被认为是腊八蒜的重要香气物质;而硫酯类化合物多有令人愉快的香味,如硫代糠酸甲酯具有奶酪香、洋葱香的香气特征。硫代糠酸酯类还具有咖啡、坚果香气,可用于调配蔬菜、水果、咖啡、奶制品、肉、海鲜等食用香精[12]。因此,为了进一步了解不同含硫化合物对白酒风味的影响,本研究进一步分析了6种武陵酱香型白酒中含硫化合物的含量差异。6种武陵酱香型白酒中含硫化合物的含量差异分析见图2。

*代表在P<0.05程度上有统计学差异,**代表在P<0.01程度上有显著统计学差异,***和****代表在P<0.001程度上有极其显著统计学差异。

由图2可知,6种不同类型的武陵酱香型白酒中,除噻烷类化合物在6种白酒中的含量无显著性差异外,硫醇类、硫酯类、多硫醚类、噻唑类、噻吩类化合物在6种白酒中的含量均具有显著性差异,但显著程度不同。硫醇类化合物包括烯丙硫醇、正丁硫醇、3-甲基-2-丁硫醇和甲硫醇,其可能是酵母对酿酒原料中的含硫蛋白质的降解产物,如甲硫氨酸的代谢产生[13]。香气活性值是表征某一香气成分对整体香气特征贡献度的指标,为香气成分的浓度与阈值的比值。甲硫醇的阈值为2.21 μg/L[14],6种白酒中甲硫醇的浓度在405.75～4 088.84 μg/L,OAV值范围为183.6～1 850.15,这表明其对白酒中的煮熟的土豆味具有重要贡献。硫酯化合物包括硫代乙酸甲酯、硫代丁酸甲酯、甲硫基乙酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、硫代乙酸糠酯和硫代糠酸甲酯。其中,硫代丁酸甲酯具有果香、奶酪香的香气特征,可用于调制水果、奶制品等食用香精,在芝麻香型白酒中曾被检出;3-甲硫基丙酸乙酯、甲硫基乙酸乙酯具有果香,是瓜果中常见的含硫化合物。甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚是2种具有肉香风味的硫醚化合物,2种含硫化合物均有极低的阈值,分别为0.8 μg/L和0.3 μg/L[14]。而甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚在6种白酒中的质量浓度分别为0.31～1.36 μg/L和0.25～0.6 μg/L,计算得出,除YJ、LJ外,甲基糠基二硫醚的OAV值范围为1.05～1.7,甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚在LJ外的其余样品的OAV值范围为1.2～2.0。因此,甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚对白酒的整体香气特征有重要贡献。二甲基三硫醚与前两种多硫醚化合物相比,质量浓度相对较高,为4.39～16.79 μg/L,其阈值为0.36 μg/L,在6种白酒中OAV值均大于1,范围为12.19～46.64。因此,二甲基三硫醚对6种白酒中的整体香气轮廓具有重要贡献。

对于噻唑类含硫化合物,仅在SJ2与LJ中存在显著性差异,其余均无显著性差异。苯并噻唑具有肉香、坚果香,可用于调配坚果、肉、可可、咖啡等食用香精。但由于其阈值较高,为3 581 μg/L,在6种白酒中OAV值均小于1,表明它对白酒的香气轮廓影响不大。2-甲基四氢噻吩-3-酮是一种具有烤牛肉的特征风味物质,在食用香精中调配饮料、奶制品、肉类等[15]。3-噻吩甲醛、2-噻吩甲醛具有油漆味、硫黄味,是热反应形成肉味的主要香气活性化合物[16-17]。噻烷类化合物在6种白酒中的含量无显著性差异,该物质的形成被认为是烯丙基硫醚类化合物分子中的不稳定C—S键发生断裂,生成了烷硫基和丙烯基自由基,其中部分自由基在发酵过程中转化为带有香气的噻烷类物质,且被认为与白酒中的大蒜味有关[18]。

2.2 挥发性含硫化合物的主成分分析结果

为了更加直观地分析6种白酒中含硫化合物的风味差异,将不同类型白酒中的挥发性含硫化合物的峰体积进行PCA分析[19]。PCA分析结果见表4,由表4可知,前7个主成分的累计贡献率为93.38%,PC1和PC2分别解释了总方差的44.1%和22.9%,两者贡献率之和为67.0%,见图3,说明数据降维后所得综合变量在二维空间能基本代表原始数据所反映的信息[20]。通过二维空间的数据分布差异可以直观地观察到组间和组内样品间的差异性,组内各样品相对距离较近或重叠,说明样品的重复性较好,不同样品各组数据的成簇区域有明显的间距,说明不同种类的武陵酱香型白酒间的特异性较明显,PCA模型能够依据GC×GC-SCD测定得到的挥发性成分对样品进行有效区分。

图3 6种武陵酱香型白酒挥发性含硫化合物 GC×GC-SCD数据的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of GC×GC-SCD data of volatile sulfur-containing compounds in 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

表4 6种武陵酱香型白酒挥发性含硫化合物GC×GC-SCD数据的主成分累计贡献率

2.3 挥发性含硫化合物的正交偏最小二乘判别分析结果

和PCA相似,OPLS-DA也是基于降维的多维向量分析方法。但是OPLS-DA为有监督的分析,可以预设分类,弥补了PCA方法的不足,强化组间差异,同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度。以GC×GC-SCD鉴定的挥发性含硫化合物的峰体积为x变量,以样品类别为y变量进行OPLS-DA分析,结果见图4。由图4可知,6种武陵酱香型白酒中含硫化合物的含量存在显著性差异,OPLS-DA分析可以实现6种武陵酱香型白酒的良好分离。OPLS-DA模型解释率参数R2Y为0.941,预测能力参数Q2为0.725,说明该模型对6种武陵酱香型白酒样品具有良好的稳定性和较好的预测能力,相较于PCA分析结果,OPLS-DA使组间差异更明显[21-22]。

图4 6种武陵酱香型白酒挥发性含硫化合物GC× GC-SCD数据的正交偏最小二乘判别分析Fig.4 Orthogonal partial least squares discriminant analysis of GC×GC-SCD data of volatile sulfur-containing compounds in 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

变量投影重要性(variable importance in projection, VIP)可以进一步量化OPLS-DA的每个变量对样品分类的贡献。VIP值越大,变量在不同样品间的差异越显著,通常可以将VIP >1表示为关键变量。从GC×GC-SCD分析结果中共筛选出14种VIP值大于1的潜在挥发性特征标志物,结果见表5。包括噻吩类4种(3-噻吩甲醛、2-噻吩甲醛、噻吩、2-噻吩羧酸乙酯),硫醇类3种(正丁硫醇、甲硫醇、3-甲基-2-丁硫醇),硫醚类2种[甲基糠基二硫醚、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚],硫酯类1种(甲硫基乙酸乙酯),噻唑类2种(苯并噻唑、4,5-二甲基噻唑),还有编号28和29的2种未准确定性的含硫组分。

表5 区分6种武陵酱香型白酒风味特征的关键挥发性含硫化合物

依据6种武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物的定量分析结果,分析得到的VIP>1的化合物中,噻吩类化合物最多,可知噻吩类化合物对于不同类型的武陵酱香型白酒风味有重要影响。噻吩类化合物的生成被认为与美拉德反应有关,高粱蛋白富含赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等氨基酸,氨基酸是酱香白酒中重要风味物质的前体物质,在酱香型白酒生产发酵过程中,高温发酵条件下与还原糖发生美拉德反应,形成一系列缩合、分解、脱羧、脱氨、脱氢等复杂反应,生成具有焙烤香的噻吩类化合物[23-24]。

3 结 论

为深入探究我国酱香型白酒中重要的痕量挥发性含硫化合物的组成,研究采用HS-SPME结合GC×GC-SCD技术,以6种产于湖南的不同类型武陵酱香型白酒为研究对象,对其中的含硫化合物进行了分析。共检出29种挥发性含硫化合物,但有2种含硫组分由于其保留时间在一维和二维时间上相近,未能准确定性。因此,本研究最终共准确定性鉴定出27种挥发性含硫化合物,主要包括4种硫醇、6种硫酯、5种多硫醚、5种噻唑、6种噻吩和1种噻烷。其中共有含硫化合物19种,非共有含硫化合物8种。采用外标曲线法对鉴定出的27种挥发性含硫化合物中在GC×GC-SCD上S/N>100的23种含硫化合物进行了定量分析。对23种定量检出的挥发性含硫化合物的峰体积进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析,发现6种不同类型武陵酱香型白酒中挥发性含硫化合物具有显著性差异。研究发现,14种变量投影值大于1的含硫化合物,可作为区分6种不同类型武陵酱香型白酒风味特征的差异组分。未能准确定性出的2种含硫组分也体现出了GC×GC-SCD方法的不足,因此,在后续工作中可与其他色谱技术共同应用于白酒含硫化合物风味物质分析。希望本研究可为酱香型白酒的调配提供数据参考,为白酒企业调控生产过程、提高产品质量提供技术支持。