不同培养基质、培养时间和处理方式对真菌处理小麦秸秆营养价值与瘤胃发酵效果的影响

王 欣， 王 慧， 田雨佳 ， 张学炜， 刘鼎阔， 胡鹏程， 魏勇跃

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 西青 300384；2.天津市生物饲料添加剂企业重点实验室，天津 西青 300383；3.天津市武清区农业发展服务中心，天津 武清 301700）

目前，玉米秸秆应用广泛，但小麦秸秆大多被浪费，从营养水平分析，二者差异不大，若能合理利用小麦秸秆，则能减轻环境压力、解决人畜争粮的矛盾。但是秸秆的内部结构复杂，植物细胞壁由纤维素嵌入交联木质素和半纤维素的无定形基质中，一同构建形成非水溶性的层状结构，阻碍酶和微生物的可及性（Chundawat 等，2011）。 研究发现真菌中的白腐真菌降解木质素的能力较强， 且具有成本低、 对环境友好的特点， 因而被广泛使用（Kainthola 等，2021；Tuyen 等，2012）。

霉菌毒素可通过多种方式进入机体， 影响机体的新陈代谢及抑制免疫机能等构成健康安全风险。 为得到与营养价值或消化性有关的分子结构信息，采用了傅立叶交换红外光谱（FTIR）技术（Zhang 和Yu，2012）。 该技术消除了传统方法中破坏分子结构的弊端，可能是预测饲料营养品质和降解特性的一种快速高效的方法。 小麦秸秆对反刍动物的营养价值需要考虑在瘤胃中的发酵特性，因此采用体外试验模拟瘤胃生理功能，探究小麦秸秆在瘤胃内的发酵效果。 本试验在课题组前期的研究基础上（张晓红等，2021），对小麦秸秆的营养价值进行探索， 旨在为秸秆的资源化利用及可持续发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 小麦秸秆 从江苏省连云港市采集小麦秸秆，粉碎至2 ～3 cm，制成风干样保存待用。

1.1.2 培养真菌 从广东省微生物菌种保藏中心购得Pleurotus eryngii（GDMCC 5.280）真菌，4 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 原代菌种扩繁 用接种铲将原代真菌接种于斜面试管培养基，于25 ℃生化培养箱培养。待菌丝布满斜面后，将其接种至培养基平板，于25 ℃生化培养箱培养。

1.2.2 Pleurotus eryngii 真菌定植培养基质 将500 g 高粱、小麦煮沸20 ～30 min，过滤水分，于121 ℃高压灭菌1 h。 将真菌菌丝分别接种至4 g高粱、8 g 小麦培养基中，25 ℃生化培养箱培养，相对湿度为70%。

1.2.3 小麦秸秆预处理 将小麦秸秆预先用蒸馏水浸泡72 h，进行后续预处理。 常规组：室温下未对秸秆进行任何预处理。 灭菌组： 称取小麦秸秆200 g/瓶于培养瓶，121 ℃下高压灭菌1 h。 微贮组： 小麦秸秆中加入1×105CFU/g 植物乳杆菌和布氏乳杆菌，1：1 混合，微贮5 d。

1.2.4Pleurotus eryngii真菌发酵试验 将包裹菌丝的培养基质和小麦秸秆依次装入培养瓶， 分别按照200 g 湿秸秆与4 g 高粱，200 g 湿秸秆与8 g小麦的比例混合均匀，保持温度为25 ℃、湿度为70%。 培养5、8、11 周时分别采集样品。 粉碎后过40 目分析筛待测，每个试样设置3 个平行。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 湿化学法测定营养指标 依据美国官方分析化学家协会（AOAC）标准方法测定小麦秸秆的干物质（DM）、粗灰分（Ash）和蛋白质（CP）（Ensminger，2008）； 利用全自动纤维分析仪（ANKOM A20000）测定粗纤维（CF）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）、木质素、 半纤维素、 纤维素的含量， 测定依据Van Soest 方法进行（Van Soest 等，1991）。

1.3.2 霉菌毒素的测定 利用PriboFastR 检测试剂盒测定呕吐毒素 （DON）、 黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、伏马毒素（FB）的含量。

1.3.3 中红外法测定分子结构 使用傅立叶变换红外光谱仪 （天津港东科技有限公司产FTIR-7600）采集样品光谱图，每个样品平行扫描9 次，扫描波段为4000 ～800 cm-1， 扫描次数为64 次，并采集空白图谱。 使用OMNIC 8.2 软件分析。

总碳水化合物（TCHO）的基线区域在ca.1189 ～902 cm-1附近，结构性碳水化合物（STCHO）的基线区域在ca.1482 ～1189 cm-1附近， 纤维性碳水化合物（CELC） 基线区域在ca.1282 ～1189 cm-1附近。

1.3.4 瘤胃体外发酵参数的测定 采用体外发酵技术，通过30 h 产气量（GP30）、氨态氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFA） 等发酵参数反映瘤胃内环境， 进一步分析真菌处理小麦秸秆后在瘤胃内的发酵效果。

1.4 统计分析 营养价值、霉菌毒素含量及碳水化合物二级分子结构试验采用SAS 9.4 的三因素MIXED 模型进行LSD 检验分析，瘤胃发酵参数采用SAS 9.4 的两因素GLM 模型进行Tukey 检验分析。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对营养价值的影响 由表1 可知， 培养基质和培养时间的交互作用对CP、ADL、 木质素以及纤维素呈极显著影响（P＜0.01），对Ash、ADF、CF 影响显著（P＜0.05）；培养基质和处理方式的交互作用对木质素有极显著影响（P＜0.01）；培养时间和处理方式的交互作用对DM、Ash、NDF、ADF、ADL、 木质素、半纤维素、纤维素均呈极显著影响（P＜0.01）。培养基质、 培养时间和处理方式三者的交互作用对CP 及木质素呈极显著影响（P＜0.01），对DM、NDF、ADF 和纤维素影响显著（P＜0.05）。

表1 不同培养基质、培养时间及处理方式对小麦秸秆中营养价值含量的影响 %

培养基质为小麦组的NDF、ADF、CF 和木质素较高粱组分别降低了3.71%、4.32%、2.90%、18.45%，小麦作为培养基效果更优；培养时间为11 周的DM、Ash、CP 高于8 周和5 周，而11 周的NDF 较5 周降低了5.06%； 处理方式对营养指标均呈极显著影响 （P＜0.01）， 灭菌组在11 周时ADL 和木质素的含量最低，相较于8 周分别降低了74.90%、31.16%， 而微贮组在8 周时NDF、ADF、CF 含量最低。综上所述，灭菌组最适培养时间为11 周，微贮组最适培养时间为8 周。

2.2 Pleurotus eryngii 真菌处理小麦秸秆对霉菌毒素含量的影响 由表2 可知， 培养基质和培养时间的交互作用对5 种霉菌毒素呈极显著影响（P＜0.01）； 培养基质和处理方式的交互作用对DON、ZEN、OTA 和FB 呈极显著影响（P＜0.01），对AFB1影响显著（P＜0.05）；培养时间和处理方式二者的交互作用对DON、AFB1、ZEN 和FB 呈极显著影响（P＜0.01），对OTA 影响显著（P＜0.05）。 培养基质、培养时间和处理方式三者的交互作用对5 种霉菌毒素均呈极显著影响（P＜0.01）。

表2 不同培养基质、培养时间及处理方式对小麦秸秆中霉菌毒素含量的影响

培养基质对DON、ZEN、FB 呈极显著影响（P＜0.01），培养基质为小麦组的ZEN、OTA、及FB 的含量较高粱组分别降低了13.85%、3.06%、10.50%；培养时间对5 种霉菌毒素均呈极显著影响（P＜0.01），随着培养时间的延长，AFB1、OTA和FB 的含量逐渐降低，ZEN 的含量逐渐递增而DON 含量先增加后降低；处理方式对5 种霉菌毒素呈极显著影响（P＜0.01）， 灭菌组和微贮组的DON 含量较常规组分别降低了36.51%、18.69%，OTA 含量分别降低了23.56%、20.51%，FB 含量分别降低了52.29%、31.06%，但所有处理组DON 和ZEN 含量均低于限量标准。

2.3Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对二级分子结构差异的影响 由表3 可知，不同培养基质、培养时间和处理方式对小麦秸秆碳水化合物二级分子结构呈极显著影响（P＜0.01）。除培养时间和处理方式二者的交互作用对CELCA 无显著影响外，其他互作均对分子结构存在显著影响（P＜0.05）。

表3 不同培养基质、培养时间及处理方式对小麦秸秆碳水化合物二级分子结构特征参数的影响

小麦组 TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH 显著高于高粱组；灭菌组总碳水化合物第一亚峰和结构性碳水化合物的峰高、峰面积高于微贮组，微贮组高于常规组，而总碳水化合物和纤维性碳水化合物的峰高、 峰面积灭菌组低于常规组和微贮组，可见灭菌组效果最好，其次是微贮组。

由表4 可知，DM 与TCHO3H、TCHO3A 呈极显著负相关（P＜0.01），与TCHO3A 的相关系数最低达到-0.725；Ash、CP 与TCHO3A 呈显著负相关（P＜0.05）；NDF 与TCHO1H、STCHOA 呈显著负相关（P＜0.05），与TCHO1A 呈极显著负相关（P＜0.01）， 与TCHO1A 的相关系数最低达到-0.622；ADF 与TCHO1H、TCHO3A 呈显著负相关（P＜ 0.05）， 与 TCHO1A、TCHO3H、STCHOH、STCHOA 呈极显著负相关（P＜0.01），与STCHOH的相关系数最低达到-0.666；ADL 与TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈极显著负相关 （P＜0.01），与TCHO1A 的相关系数最低达到-0.742； 木质素与TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈极显著负相关（P＜0.01）， 与TCHO1A 的相关系数最低达到-0.674；半纤维素与CELCH、CELCA 呈显著正相关（P＜0.05）， 与CELCA 的相关系数最高达到0.540； 纤维素与TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈显著正相关（P＜0.05），与CELCA 呈显著负相关（P＜0.05）， 与TCHO1A 的相关系数最高达到0.523。

表4 不同培养基质、培养时间及处理方式对小麦秸秆营养组分与二级分子结构特征参数的相关性

2.4Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对瘤胃体外发酵30 h 参数的影响 由表5 可知，培养时间对VFA 和TVFA 呈极显著影响 （P＜0.01），处理方式对瘤胃参数均呈极显著影响（P＜0.01）；培养时间和处理方式的交互作用对VFA 和TVFA呈极显著的影响（P＜0.01），对GP30影响显著（P＜0.05）。 灭菌组的GP30显著高于常规组和微贮组；pH 均在标准界限内。 灭菌组与微贮组的NH3-N较常规组分别降低了44.86%和17.03%。 体外发酵30 h 时，常规组乙酸含量低于灭菌组低于微贮组； 灭菌组丙酸含量高于微贮组高于常规组；乙酸：丙酸在8 周的浓度显著低于11 周显著低于5周， 灭菌组显著低于微贮组低于常规组 （P＜0.01）；微贮组TVFA 浓度显著高于灭菌组和常规组（P＜0.01）。

表5 Pleurotus eryngii 真菌处理小麦秸秆对瘤胃发酵30 h 参数的影响

3 讨论

3.1Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对营养价值含量及分子结构特征的影响 本试验中小麦组的NDF、 木质素低于高粱组， 且TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH 均显著高于高粱组，从营养组分和分子结构参数水平表明，小麦作为培养基质的营养价值优于高粱， 隋春丽等（2022）表明，小麦能够提取更多的营养物质；微贮组中，小麦组8 周时木质素最低，为4.61，此时纤维素含量最高，为39.69，较高的木质素含量会使纤维素和半纤维素无法被微生物降解， 进而降低可消化率（Abrahamsen 等，2021）；NDF、ADF 等纤维组分含量越高， 营养价值和能量利用效率越低。随着培养时间的延长，灭菌组NDF、ADF、木质素等纤维含量极显著降低，CP 含量提高， 说明通过处理可有效改善小麦秸秆营养价值 （Qutab ud din 和Macit，2020；刘红菊，2018）。

3.2Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对霉菌毒素含量的影响 本试验表明， 随着培养时间的延长，AFB1、OTA 和FB 的含量逐渐降低，Juodeikiene 等（2018）研究显示，DON、T-2 和HT-2 毒素浓度降低， 表明在培养基质中产生大量醋酸的LAB 菌株可降低麦芽颗粒中的霉菌毒素污染。 ZEN 含量呈现增加的趋势，可能原因是初期利用营养物质代谢产生ZEA，随着霉菌数量的减少，ZEN 不断积累，其含量逐步上升，这与王旭哲（2016）的研究结果相似。 本试验的样品中均检测到了霉菌毒素的含量，但并未发现霉变样品，Manni 等（2022）也均在霉变和非霉变样品中发现了霉菌毒素。 灭菌组中DON、OTA 和FB 含量低于微贮组和常规组， 说明灭菌处理抑制了部分有害微生物的生长。

3.3Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对营养组分与二级分子结构特征参数相关性分析 本试验中NDF、ADL 和木质素与TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 存在负相关。 Ji 等（2017）也表明，NDF 和ADF 均与TCHO1A 呈负相关。 ADF 与TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH、STCHOA呈负相关。 Chen 等 （2014） 研究显示，ADF 与STCHOA、CELCA、TCHO1A、TCHO2A 和 TCHOA呈负相关。 NDF、ADL 与CELCH、CELCA 呈正相关，这与Zhang 和Yu（2012）的研究报道相似，说明真菌处理能通过改变纤维素结构进而影响秸秆纤维成分含量。 纤维素与CELCA 呈负相关，而半纤维素与CELCH、CELCA 呈正相关，Xin 和Yu（2013） 在研究芸苔中得出，CHO 和CELC 峰强度的变化与试样的碳水化合物化学组成二者紧密相关。 本试验进一步论证，Pleurotus eryngii 真菌处理小麦秸秆可有效改善秸秆纤维素结构进而影响纤维成分含量。

3.4Pleurotus eryngii真菌处理小麦秸秆对瘤胃发酵参数的影响 体外产气法因其试验可控性、对大量基质无损筛选的能力和相对较低的成本而被研究人员广泛应用。 瘤胃微生物的发酵产气量与饲料降解率呈正相关，饲料可发酵程度越高，微生物活性越强，产气量越多（Suntara 等，2020）。 本试验中，灭菌组的GP30最高；且GP30与NDF 呈负相关，表明饲料中NDF 含量高通常与DM 降解率降低有关， 从而与低GP30有关 （Maccarana 等，2016）。 瘤胃微生物的活性、生长繁殖均受pH 的影响，本试验pH 均在正常范围。NH3-N 可反映饲料蛋白质和氨基酸分解的程度（张玲等，2019）。本试验中，灭菌组的NH3-N 含量最低，微贮组低于常规组，李胜楠等（2022）研究发现，F、X 和FX 组青贮饲料的NH3-N／TN 显著低于CK 组。

微贮组TVFA 的浓度显著高于灭菌组和常规组，说明消化率较高的底物，在发酵中瘤胃微生物更容易获得可发酵碳水化合物， 从而产生较高的TVFA；Datsomor 等（2022）表明，平菇处理水稻秸秆后TVFA 增加， 而使用黄孢菌后导致TVFA 下降。 易于发酵的碳水化合物浓度更高，NDF 更低，这导致瘤胃中乙酸：丙酸更低（Daza 等，2019）。 本试验中，灭菌组的乙酸：丙酸最低，说明灭菌组的瘤胃饲料效率最高。

4 结论

Pleurotus eryngii真菌在保证饲料安全性的前提下处理小麦秸秆，可有效改善样品的纤维组分、更好的发挥出小麦秸秆的营养价值， 并能够分解饲料原料中的蛋白质和氨基酸， 同时将碳水化合物转化为挥发性脂肪酸为动物提供能量。 综合评价，以小麦作为培养基质，灭菌组发酵培养11 周，微贮组培养8 周是最佳选择。