补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群的影响

钟浩杰， 姚新奎，2，3 ， 孟 军，2，3， 姚岳扬， 杨钰瑶， 王川坤

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆马繁育与运动生理重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052；3.新疆农业大学马产业研究院，新疆 乌鲁木齐 830052；4.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆 乌鲁木齐 830052）

马的胃肠道系统庞大而复杂， 包含多种不同的微生物（Julliand，2016；Dicks，2014），机体所需的大部分能量是通过微生物分解结构性碳水化合物获得（Julliand，1999）。 肠道菌群在营养消化、维持动物健康和生产性能方面起着至关重要的作用。 微生物群通常是指存在于胃肠中所有的微生物集合， 而微生物组成则是生物因素和非生物因素的统一， 包括微生物及其基因组（Marchesi，2015）。肠道菌群在马属动物的健康维持和疾病的病理生理学中扮演者重要的角色（Jassim，2009）。除了参与营养物质的消化， 也在免疫功能中发挥一定的作用。 同时，与肠脑轴、动物行为（Cryan，2012）、 糖尿病和肥胖有关（Biddle，2018；Morrison，2018；Leyre，2006）。 尽管肠道内的微生物群落具有明显的重要性，但与其他动物物种相比，对马肠道菌群的特征认识还远远不足。

近年来， 人们将微生物发酵技术广泛应用于饲料研究中以缓解我国优质蛋白质饲料的供需矛盾。发酵豆粕在牛、羊、猪、鸡以及水产等动物营养研究中取得了一定的研究成果， 但是鲜见其在马匹上的研究报道。因此，本试验旨在研究补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群多样性以及菌群结构组成的影响， 以此探究发酵豆粕在伊犁马驹专用饲料中的应用效果， 为伊犁马驹专用饲料研发以及消化系统健康提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与设计 本试验于2021 年5 月至10 月在新疆昌吉良源农牧业发展有限公司马场进行，选取15 匹体况相近、无消化系统疾病病史的12 月龄伊犁马驹，随机分为3 组，每组5 匹马。对照组、 试验I 组和试验II 组分别在干草和普通精饲料的基础上添加5%的普通豆粕、2.5%普通豆粕+2.5%发酵豆粕和5%的发酵豆粕。 分别饲于不同圈舍，预饲7 d，试验期为56 d，整个试验过程中， 所有马均为舍饲， 垫料选取清洁干燥的木屑，每天分3 次给料，自由饮水和舔食舔砖。

1.2 基础饲料 试验所用发酵豆粕由新疆酵博仕生物科技有限公司生产，菌种为植物乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母等。 试验过程中，所有试验马匹每天饲喂干草1.5 kg/100 kg 体重，每天按照每匹马驹体重的1%饲喂精饲料。 精饲料组成及营养水平见表1。

1.3 试验样品采集 分别于试验第0 天和56 天无菌采集所有试验马匹直肠粪便， 所有用于肠道菌群多样性分析的样品均收集在无菌的5 mL 冻存管中，样品立即放入液氮中储存，直到DNA 提取和微生物测序。

1.4 粪便样品16S rRNA 高通量测序 首先提取肠道菌群总DNA 并扩增， 然后对PCR 产物定量和混样以及文库的构建，最后上机测序。测序由上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.5 统计与分析 用Excel 2019 对数据进行整理；用SPSS 26.0 软件对Alpha 多样性和分类学组成进行分析； 对照组、 试验I 组和试验II 各组间Alpha 多样性指数以及门、科、属丰度采用单因素方差分析，并采用Duncan’s 法多重比较；试验0 d和56 d 的Alpha 多样性指数以及门、科、属丰度比较采用独立样本t 检验；结果用平均值表示。

2 结果

2.1 测序结果与Alpha 多样性分析 由表2 可知， 试验0 d 和56 d 的30 个样品共获得有效序列2672029 条和32234 个ASVs。

试验0 d 和56 d 的覆盖率均超过96%，说明本试验检测到了96%以上的肠道细菌。 肠道菌群丰富度指数显示，各组的超1 指数、观察物种数和香浓指数在试验第56 天较试验第0 天均有所下降，其中对照组第56 天观察到的物种数显著低于第0 天（P＜0.05），试验I 组第56 天的香浓指数显著低于第0 天（P＜0.05）。

2.2 Beta 多样性分析 图1 为基于ASV 水平的PCoA 分析结果。试验第0 天，PCo1 对检测到的总细菌的代表性贡献率为15.7%，PCo2 贡献率为12.7%。 试验第56 天，PCo1 贡献率为16%，PCo2贡献率为11.7%。 试验第56 天的PCoA 分析结果显示，对照组、试验I 组和试验II 组中的大部分个体能够明显的分开， 说明补喂发酵豆粕对马驹肠道菌群组成具有明显的调节作用。

图1 主坐标分析

2.3 物种组成分析

2.3.1 补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群门水平丰度的影响 补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群门水平多样性结果如表3 所示， 基于门水平统计分析，得到相对丰度排名前10 的门，分别为厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门、变形菌门、疣微菌门、纤维杆菌门、放线菌门、TM7、柔壁菌门以及SR1。随着马驹日龄增加，对照组56 d 变形菌门丰度极显著高于0 d（P＜0.01）；试验I 组56 d 螺旋菌门丰度极显著低于0 d （P＜0.01）； 试验II 组56 d变形菌门丰度显著高于0 d（P＜0.05），56 d 的放线菌门丰度显著低于0 d（P＜0.05）。 随着发酵豆粕添加量的增加， 各试验组肠道菌群门水平丰度与对照组无显著性差异。

表3 肠道菌群门水平丰度 %

2.3.2 补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群科水平丰度的影响 由表4 可知，通过统计分析，得到丰度前10 的科，分别是毛螺旋菌科、瘤胃球菌科、普雷沃氏菌科、链球菌科、韦荣氏球菌科、艰难杆菌科、螺旋体科、梭菌科、BS11 和RFP12。随着马驹日龄增加， 对照组56 d 梭菌科丰度极显著高于0 d（P＜0.01），56 d 的艰难杆菌科丰度显著低于0 d（P＜0.05）； 试验I 组56 d 链球菌科丰度极显著高于0 d（P＜0.01），56 d 的毛螺旋菌科丰度显著低于0 d （P＜0.05）。 随着发酵豆粕添加量的增加，试验56 d 时，试验II 组瘤胃球菌科丰度显著高于对照组（P＜0.05），试验II 组链球菌科丰度显著低于对照组（P＜0.05），试验I 组艰难杆菌科显著高于对照组（P＜0.05）。

表4 肠道菌群科水平丰度 %

2.3.3 补喂发酵豆粕对伊犁马驹肠道菌群属水平丰度的影响 基于属水平的伊犁马驹肠道菌群结构分析如由表5 所示。 随着马驹日龄增加，对照组56 d 梭菌属丰度极显著高于0 d（P＜0.01）；试验I组56 d 链球菌属丰度显著高于0 d（P＜0.05），56 d的考拉菌属丰度显著低于0 d （P＜0.05），56 d 的密螺旋体属丰度极显著低于0 d（P＜0.01）；试验II 组颤螺菌属丰度显著高于对照组（P＜0.05）。随着发酵豆粕添加量的增加，试验56 d 时，试验II组链球菌属丰度显著低于对照组（P＜0.05），试验II 组颤螺菌属丰度极显著高于对照组（P＜0.01）。

表5 肠道菌群属水平丰度 %

3 讨论

目前，发酵豆粕在牛、羊、猪、鸡以及水产等动物营养研究中获得了一定的研究成果。 党文庆等（2020） 在研究不同含量发酵豆粕对断奶仔猪粪便微生物的影响中发现，试验组大肠杆菌丰度较对照组显著降低（P＜0.05），10%和15%发酵豆粕添加组沙门氏菌数量分别显著低于CK 和5%发酵豆粕添加组（P＜0.05）。张晨等（2018）在颗粒型TMR 日粮对育肥羊生产性能及其影响机制研究中发现，通过添加发酵豆粕和颗粒化处理相较于常规TMR 日粮组可以显著提高瘤胃内普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的相对丰度。毕艳丽等（2021）研究发酵大豆粉对肉鸡肠道菌群的影响，结果显示，与对照组相比，发酵大豆粉2 组和发酵大豆粉3 组大肠杆菌较对照组分别降低20.24%和22.47%，差异显著；发酵大豆粉2 组和发酵大豆粉3 组乳酸杆菌较对照组分别提高19.86%和22.87%。

非培养微生物鉴定方法和生物信息学的发展对马肠道菌群的研究奠定了基础， 促进了对微生物的基因组及其与环境之间相互作用规律的认识。 本试验使用Illumina 高通量测序技术对试验马驹的粪便样品进行测序，结果显示，从15 匹伊犁马驹的30 个粪便样品中共检测出2672029 条有效序列和32234 个ASVs，由于高通量测序技术的进步以及序列处理分析方法的改进， 测序结果相较前人的研究有了大幅的提高。

以干草为基础饲料的马中， 细菌群落表现出较高的丰富度和多样性， 表明后肠微生物生态系统具有很强的恢复力。 而高淀粉饮食对后肠微生物种群有明显的不良影响（Julliand，2017）。 本试验56 d， 对照组观察到的物种数和试验I 组香浓指数均显著低于0 d，56 d 各组其他多样性和丰富度指数较0 d 均有所下调。 这一结果可能是由于马驹饮食结构的突然改变引起的，0 d 前的饮食主要以干草为主， 试验开始后添加一定量的精饲料，导致淀粉的摄入量迅速升高。饮食结构对马肠道菌群的影响有待进一步研究。

本试验从门、科、属三个分类水平上对伊犁马驹肠道菌群组成结构进行了研究。基于门水平统计分析，厚壁菌门和拟杆菌门是马肠道菌群中的优势菌门，两者丰度高达90%以上，这与前人的研究结果 一 致 （Hansen，2015；Moreau，2014；Dougal，2013）。试验56 d 时各组肠道菌群门水平丰度均无显著差异，可能由于试验期间，12 月龄马驹肠道菌群趋于稳定，与成年马接近，随时间变化幅度不大，这与Costa（2016）研究结果基本一致。 变形菌门在肠道中的多样性是由从环境中摄取的细菌驱动的，变形菌门始终在马消化道（Ericsson，2016）的上部占主导地位，在马回肠中丰度最高，为33%（Costa，2015）。变形菌门维持肠道菌群结构的稳定性，是哺乳动物肠道健康的关键指标（Shin，2015）。 放线菌是一种条件致病菌，可引起腹泻、脑膜炎、肺炎、化脓性肾炎或脓毒性多关节炎和败血症，表明其平衡对动物的健康至关重要（Layman，2014）。 本试验II组56 d 的变形菌门丰度显著高于0 d，56 d 放线菌门丰度较0 d 显著降低， 表明添加5%的发酵豆粕能够增加马驹肠道菌群中变形菌门的丰度，降低放线菌门的丰度， 从而促进肠道菌群结构的稳定，抑制腹泻和炎症的发生。 Fernando 等（2010）研究发现， 螺旋体门在纤维的发酵中发挥着重要作用，饲料中可发酵碳水化合物作为细菌的主要能量来源，导致淀粉降解菌的增加， 与纤维降解菌直接竞争，引起螺旋体门和密螺旋体丰度降低。本试验中螺旋体门和密螺旋体丰度降低与其基本一致。瘤胃球菌科属于厚壁菌门，其丰度虽然只占细菌群落的一小部分，但被认为是整个马后肠的“核心”。 瘤胃球菌参与植物细胞壁的降解，它们的缺失可能会影响微生物群的整体平衡（Julliand，2017）。 本试验在56 d时试验II 组瘤胃球菌科丰度显著高于对照组，表明部补喂发酵豆粕能够提高肠道菌群中瘤胃球菌科相对丰度，提升消化能力。 链球菌科属于乳酸杆菌目， 包括一些产乳酸的细菌， 如链球菌（Fombelle，2001）。 研究发现，链球菌科是健康马后肠生态系统中的主要细菌类群之一（Mshelia，2018；Steelman，2012），但是，链球菌的增殖与碳水化合物诱导的蹄叶炎的发病密切相关（Milinovich，2010）。本试验中56 d 时试验II 组链球菌科与链球菌属丰度显著低于对照组，说明补喂发酵豆粕能够有效预防蹄叶炎的发生。

4 结论

本试验结果表明，补喂发酵豆粕可显著提高马驹肠道菌群变形菌门和瘤胃球菌科的相对丰度，显著降低螺旋体门、 放线菌门以及链球菌科的丰度，有效提升马驹的消化能力，预防蹄叶炎、腹泻以及炎症的发生，同时，促进了马驹肠道菌群的稳定性。