添加天然抗氧化剂对宠物罐头空气暴露后菌落总数及过氧化值的影响

张 至， 蔡 旋， 赵熠群， 赵 念， 周晨露， 陈 国

（1.上海农林职业技术学院，上海 201699；2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；3.上海比瑞吉宠物用品有限公司，上海 201107）

宠物罐头食品因其生产工艺能够完全杀灭包装内的微生物，且与外界空气完全隔绝，在灭菌、密封等环节达到技术要求时， 罐内食物不会产生腐败变质的问题（周立新等，2003）。但是犬猫采食罐头环境复杂，常常是放置于容易扬尘的地面，或是容易接触毛发等污染物的笼具内，且犬猫（尤其是猫）在采食时时常无法一次性吃完整个罐头，而使得罐头在高污染环境下暴露较长时间。 据笔者调研， 一些宠物主人会将罐头放置在宠物进食的区域12 h 甚至更长，有些甚至是在感觉到罐头散发异味时才予以丢弃。 宠物罐头内含有较为丰富的营养成分，水分充足，极其适合微生物生长；宠物罐头通常脂肪含量也较高， 在空气中长时间暴露容易氧化变质。 变质的宠物食品被食用会对宠物健康造成不良影响（Leiva 等，2019）。

在膨化宠物食品中，包括维生素C（VC）、维生素E（VE）、茶多酚（TP）、迷迭香提取物在内的天然抗氧化剂受到消费者的认可。 抗氧化剂能够抑制油脂的酸败，减缓食物的变质过程；一些天然抗氧化剂还具有抑菌作用。 同时，也有研究表明，犬猫存在多种因素引起的氧化应激， 补充抗氧化剂能够对犬猫健康起到积极的作用 （Hagen 等，2019；Beigh 等，2016；张玉蝶，2016）。 因此，本研究探讨几种常见天然抗氧化剂在罐头加工工艺中的热稳定性， 并分析添加不同浓度的天然抗氧化剂对狗粮罐头在典型环境（狗舍、洁净室内）暴露24 h 内变质程度的影响，以期为天然抗氧化剂在宠物罐头中的添加提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 维生素C、维生素E、茶多酚由上海比瑞吉宠物用品有限公司提供， 迷迭香提取物（包括水溶性，REW；脂溶性，REO）由湖南先伟阳光生物科技有限公司提供。

试验所用基础罐头由上海比瑞吉宠物用品有限公司提供，主要原料为牛肉、鸡肉、青豆，罐头不含有防腐剂及抗氧化剂成分。

DPPH 自由基和ABTS 自由基测定试剂盒，还原力测定试剂盒购自上海琮益科技有限公司；分析纯丙酮、 乙醇及营养琼脂培养基均购自国药集团化学试剂有限公司； 过氧化值检测试剂套装购自北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 仪器与设备 高压灭菌锅购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Sunrise 酶标仪购自奥地利Tecan 公司；雷磁PHS-3C pH 计购自上海仪电科学仪器股份有限公司； 全自动生化分析仪购自北京普析通用仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 五种天然抗氧化剂的高温杀菌处理 维生素C、维生素E、茶多酚、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物配制成100 μg/mL 溶液， 然后稀释至5 ～50 μg/mL。置于耐压试管中，采用反式高压灭菌锅121 ℃湿热灭菌30 min。 待恢复至室温后取出，与未灭菌样品一同进行抗氧化试验。

1.3.2 灭菌前后天然抗氧化剂抗氧化能力比较灭菌前后天然抗氧化剂的DPPH 自由基、ABTS自由基清除能力及铁离子还原能力均采用上海琮益科技有限公司生产的试剂盒测定， 测试操作按照说明书要求进行。

1.3.3 含不同抗氧化剂的罐头制备 罐头的制备由上海比瑞吉宠物用品股份有限公司代加工，为圆柱形马口铁罐头，上盖直径83 mm，罐内食品净含量160 g。 所有测试抗氧化剂随维生素及微量元素一同加入，经工艺稳定性验证，各成分在罐头原料中分布均匀。 制备好的罐头置于阴凉洁净仓库中存放，并于30 d 内开展空气暴露试验。

1.3.4 罐头的空气暴露 所有罐头分别置于洁净的室内（办公室办公桌上）和犬舍（上海市农林职业技术学院实训基地） 中犬只接触不到的地面，每处环境（办公室或犬舍）分距离较远的3 处摆放， 保持正常通风， 两处场所均控制气温为（20±2）℃。

每2 h 取样一次， 每次取样时均采用无菌采样袋从每个点立即进行菌落总数测定、pH 测定和样品过氧化物值分析。

1.3.5 罐头菌落总数的测定 罐头各暴露时间段菌落总数按照GB 4789.2—2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》 方法进行测定。

1.3.6 罐头pH 的测定 罐头各暴露时间段pH按照GB 5009.237—2016 《食品安全国家标准食品pH 的测定》方法进行测定。

1.3.7 罐头过氧化值的测定 罐头各暴露时间段过氧化值采用普析通用公司生产的试剂盒测定，操作参照说明书要求进行。

1.4 数据统计 试验数据采用Excel 2019 进行初步计算和整理，采用SPSS 19.0 进行统计分析，数据表示为“平均值±标准差”形式。 灭菌前后抗氧化能力数据采用配对T 检验分析；其余数据利用单因子方差分析（One way ANOVA）进行差异显著性检验，差异显著水平为P＜0.05，差异显著时采用LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 天然抗氧化剂耐受湿热灭菌的能力 如图1所示， 经121 ℃湿热灭菌后所有抗氧化剂的EC50均有上升， 其中VC、VE、REO、REW 的DPPH 自由基清除能力EC50显著上升（P＜0.05）；TP、REO的ABTS 自由基清除能力EC50显著上升 （P＜0.05）。其中湿热灭菌前后TP 和REO 的EC50变化较大，TP 的DPPH 自由基清除EC50灭菌后提高29.31%，ABTS 自由基清除EC50灭菌后提高210.95%；REO 的DPPH 自由基清除EC50灭菌后提高296.64%，ABTS 自由基清除EC50灭菌后提高67.98%， 其余抗氧化剂灭菌前后DPPH 和ABTS 自由基清除EC50变化均小于7%。表明VC、VE、REW 耐受湿热灭菌能力较好， 而TP 和REO在湿热灭菌过程中抗氧化性能损失较大。

图1 常见天然抗氧化剂湿热灭菌前后抗氧化能力变化

2.2 添加天然抗氧化剂对犬罐头空气暴露后菌落总数的影响 如图2、图3 所示，与未添加抗氧化剂（对照）比较，添加了抗氧化剂的罐头在空气中暴露24 h 内菌落总数均显著降低。 在空气暴露中，随时间的推迟，所有罐头的菌落总数均有增加，但仍接近线性增长，提示在空气暴露24 h后，罐头内菌群尚未进入对数生长期。比较同一环境下相同抗氧化剂对菌落总数的抑制效果可知，高浓度的抗氧化剂（500 mg/kg）添加对罐头中菌落的抑制优于低浓度抗氧化剂（100 mg/kg）；比较办公室环境下不同抗氧化剂在试验结束时（24 h）对菌落总数的抑制效果可知， 低剂量维生素C、维生素E 和脂溶性迷迭香提取物（REO）添加组空气暴露24 h 后菌落总数接近 （4.3×104～4.7×104CFU）， 低于茶多酚和脂溶性迷迭香提取物（REW）添加组空气暴露24 h 后菌落总数（7.2×104～7.7×104CFU）， 狗舍环境中低剂量抗氧化剂添加组对罐头总菌数影响与办公室类似，提示低剂量（100 mg/kg）维生素C、维生素E 和脂溶性迷迭香提取物添加抑菌效果优于茶多酚和脂溶性迷迭香提取物添加。本次试验狗舍环境放置的罐头24 h 后菌落总数均显著高于办公室环境（P＜0.05），但差异较小。

图2 添加天然抗氧化剂对办公室中放置成犬罐头菌落总数的影响

图3 添加天然抗氧化剂对犬舍中放置成犬罐头菌落总数的影响

2.3 添加天然抗氧化剂对犬罐头空气暴露后pH的影响 如表1、表2 所示，犬罐头空气暴露24 h内pH 均尚无明显变化， 这可能与罐头菌落尚未对数增长有关。

表1 添加天然抗氧化剂对办公室中放置成犬罐头pH 的影响

表2 添加天然抗氧化剂对犬舍中放置成犬罐头pH 的影响

2.4 添加天然抗氧化剂对犬罐头空气暴露后过氧化物值的影响 如图4、图5 所示，所有犬罐头在空气中暴露24 h 后过氧化值均有上升。但添加有抗氧化剂的犬粮罐头所有时间段过氧化物值均低于对照组，高剂量（500 mg/kg）的抗氧化剂添加对罐头的保护作用优于同种低剂量 （100 mg/kg）的抗氧化剂添加。比较办公室环境中暴露24 h 后罐头过氧化物值可知，维生素E 和茶多酚类似（P＞0.05）， 优于其余抗氧化剂：24 h 时所有添加低剂量抗氧化剂的罐头过氧化物值大小顺序为VC＞REO ＞REW ＞TP = VE（此处“=”表示平均值无显著差异，P＞0.05，下同），所有添加高剂量抗氧化剂的罐头过氧化物值大小顺序为VC ＞REO ＞REW ＞VE = TP， 高低剂量不同抗氧化剂的保护能力顺序完全一致； 比较犬舍环境中暴露24h 后罐头过氧化物值可知，24 h 时所有添加低剂量抗氧化剂的罐头过氧化物值大小顺序为VC ＞REO＞REW ＞TP = VE， 所有添加高剂量抗氧化剂的罐头过氧化物值大小顺序为TP＞VC = REO ＞REW ＞VE，与犬舍环境中得到的结论略有不同，主要是茶多酚（TP）变化较大，其机理未知。 所有结果均提示在保护罐头食品过氧化物产生方面，维生素E 是一种优良的天然抗氧化剂。

图4 添加天然抗氧化剂对办公室中放置成犬罐头过氧化值的影响

3 讨论

人类与宠物饮食方式的不同， 使得在罐头食品采食时犬猫不能同人类一样开盖后即食用完毕，长期空气暴露的罐头极易滋生病菌，不仅造成宠物本身健康问题，还会散发恶臭，影响人类的居住环境。 采用一定的方式延长罐头开盖后的保质期， 避免罐头食品过快腐败能够给宠物饲养带来更好的体验。

本研究选取两个较有代表意义的环境进行测试，一是采用空调通风的办公室环境，与居家环境类似；二是犬舍中犬只接触不到的区域，与养殖宠物的家庭环境类似。 本研究发现两种环境中菌落数增长相差不大， 犬舍环境中罐头中菌落增长仅略高于办公室环境，可能与犬舍经常消毒有关。本研究中，在24 h 观测期内罐头中的菌落均尚未进入对数生长期， 呈线性增长，24 h 时均超过1.0×105CFU/g，已高于我国熟肉制品的菌落总数要求（GB 2726-2016）上限，但符合GB16869-2005《鲜、冻禽产品》规定（菌落总数≤1.00×106CFU/g）。 目前鲜有24 h 内空气暴露中罐头食品菌落数变化的研究，刘梦竹等（2023）将稻香鸡常温（25 ℃）放置12 h 后菌落总数达到5.00×106CFU/g，24 h 后的菌落总数接近1.00×109CFU/g，与之不同的是，本研究中罐头在开盖前是无菌的， 且试验温度略低（20 ℃），因此菌群在罐头中适应期较长，但可以预见，后期罐头内细菌会快速增殖，进入对数生长期。 另外，本研究中罐头均为环境中静置，未经过犬猫舔舐。犬猫口腔中存在大量菌落，在舔舐过程中会带入罐头中，加速罐头的变质。 因此，在现实环境中，罐头内菌群会更快进入对数生长期。食品pH 的改变与其内产酸菌增长密切相关， 本研究中所有罐头试验期间pH 均未显著改变， 与菌群增长尚未进入对数期有关。

犬猫罐头为提高适口性，往往油脂含量较高，一些罐头中脂肪含量可达30%以上 （陈国等，2021），油脂氧化会产生不愉快的哈喇味，犬猫的嗅觉极为灵敏（刘策等，2020），哈喇味的产生会给犬猫造成采食欲望的降低， 进一步导致罐头食品采食周期延长。本研究数据表明，随空气暴露时间的延长，罐头油脂表现出明显的氧化现象；同时，本研究也表明不同抗氧化剂均能够较好的抑制罐头食品的油脂氧化， 提示在宠物罐头食品中使用抗氧化剂的必要性。

罐头食品加工工艺的特殊性使其必需将所有原料一起灭菌， 因此原料的耐高温能力非常重要（刘策等，2022）。 DPPH 自由基和ABTS 自由基清除试验是常见的评价化合物抗氧化能力的方法，因此本试验比较了常见罐头灭菌程序对饲料级维生素C、维生素E、茶多酚、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物灭菌前后的抗氧化能力。尽管有研究表明维生素C 在煮沸过程中损失可以高达75%（Leková 等，2006），油炸过程中维生素E 也有一定损失（Bramley 等，2000），但本研究发现维生素C 及维生素E 溶液在经过高压灭菌30 min 后，其DPPH 和ABTS 自由基清除能力损失较小；在宠物饲料茶多酚一般是包含表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）、儿茶素（C）在内的一系列混合物， 迷迭香提取物分水溶性和脂溶性，水溶性产品主要成分是迷迭香酸，脂溶性产品主要成分是鼠尾草酸和鼠尾草酚（Xie 等，2017）。 目前有关热稳定的报道较少，但有关茶多酚和迷迭香提取物保护高温油脂有较多研究 （高浩祥等，2020；Guo 等，2016）。本研究发现水溶性迷迭香提取物耐湿热灭菌能力较强，但茶多酚及脂溶性迷迭香提取物在灭菌后抗氧化能力损失较大。

4 结论

本研究结果提示，与维生素C、茶多酚、水溶性迷迭香提取物相比，维生素E、脂溶性迷迭香提取物在抑制罐头油脂氧化、 抑制菌群生长方面均具有一定优势， 但脂溶性迷迭香提取物热稳定性仍需进一步论证。 因此综合各项指标， 维生素E是一个较优的选择。