SPE-HPLC-UV 法测定绞股蓝提取物中皂苷的含量

陈 晗， 杨悠悠， 赵青余， 张军民， 余雅男 ， 张 凯

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；3. 青岛特种食品研究院，山东 青岛 266109）

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本药食两用植物，《中华本草》记载，绞股蓝别名为七叶胆、小苦药、公罗锅底、落地生等（国家中医药管理局《中华本草》编委会，1999），在日本还被称为“甘茶蔓”。我国绞股蓝的三大产区分别为陕西安康平利、 广西金秀和湖北神农架地区， 分布广泛， 资源丰富 （李华等，2015）。 绞股蓝在我国具有悠久的药用历史，根据《本草纲目》记载，其具有消炎解毒、止咳祛痰、清热补虚的功效。 在1986 年的国家科委的“星火计划” 中， 由于突出的药用价值绞股蓝位居待开发“名贵中药材”之首（史琳等，2011），并在2020 年被卫生部纳入保健品名录。 绞股蓝含有多种生物活性成分，包括皂苷、黄酮类化合物、多糖、氨基酸、微量元素以及其他多种化学成分（鲍凤霞等，2018），绞股蓝皂苷一直是研究热点，并且被认为是绞股蓝中主要发挥生物活性的物质。 研究表明绞股蓝含有Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3 等多种皂苷， 具有相似的骨架结构 （Su 等，2021；Ha 等，2019），都属于达玛烷型四环三萜，且部分绞股蓝皂苷在体内可以转化为稀有的人参皂苷（郑溢等，2018）。 因此绞股蓝皂苷，具有神经保护（Park 等，2020）、抗氧化（Seo 等，2017）、抗癌症（Ma 等，2019；Xing 等，2018）、抑菌（Srichana 等，2011）、抗衰老（Phu 等，2020）、降血糖（Zhu 等，2021）、调节血脂、 保护肝脏、 调节肠道微生物 （Zhang 等，2021；Huang 等，2019；Khan 等，2019；Bae 等，2018）等多种功能。在“禁抗、限抗”的大背景下，绞股蓝已列入我国《饲料原料目录》，其产品的市场需求也日益强烈。

目前，有采用UPLC-Q-Trap-MS 法对绞股蓝药材中的9 种皂苷成分含量进行测定 （Duan 等，2021），HPLC-UV-ELSD 法对绞股蓝药材中槲皮素、芦丁、绞股蓝皂苷A 和绞股蓝皂苷XLIX 4 种指标性成分的含量进行测定与分析（王源源和丁鹏，2021），RP-HPLC-ELSD 法对绞股蓝药材中的皂苷含量进行测定（李浩飞，2015），HPLC-QAMS法对药品清肺散结丸中绞股蓝皂苷ⅩLⅨ、 绞股蓝皂苷A 和绞股蓝皂苷ⅩⅦ的含量进行测定（周颖等，2020），HPLC 法对药品绞股蓝总苷分散片中绞股蓝皂苷A 的含量进行测定（徐文峰等，2019）。对绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷含量测定的研究较少，且我国尚未制定有关饲料原料绞股蓝粗提物质量评价相关标准。本研究通过对色谱条件及前处理进行研究、优化，旨在建立SPE-HPLC-UV 法测定绞股蓝三萜皂苷含量，为绞股蓝粗提物作为饲料原料使用时，其中三萜皂苷（绞股蓝皂苷A 和绞股蓝皂苷XLIX）含量的测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 高效液相色谱仪（1290 Infinity II）；KQ-500DE 型数控超声仪 （昆山市超声仪器有限公司）；HD-2500 型多管涡旋混合仪（杭州佑宁仪器有限公司）；XP-205 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Avvanti J-26S XP 高速冷冻离心机；SPE 固相萃取萃取柱：Cleanert S C18（60 mg/ 3 mL 50/pkg）；固液萃取减压净化系统。

乙腈和甲醇均为色谱纯，均购于Fisher 试剂公司；正丁醇和乙醇为色谱纯，均购于Macklin 试剂公司；屈臣氏蒸馏水；绞股蓝XLIX 标准对照品和绞股蓝A 标准对照品来自军事医学科学院马百平研究员团队（纯度≥98.0%）。市场采购绞股蓝提取物样品6 批，编号为S1 ～S6，规格均为提取率20∶1。

1.2 色谱条件 色谱柱：Kinetex C18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，2.6 μm）；柱温：40 ℃；以水-乙腈为流动相；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱见表1；检测器：紫外检测器；检测波长：203 nm。混合对照品高效液相色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱

1.3 溶液配制

1.3.1 标准品溶液配制 精密称取并记录绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 标准对照品， 用色谱纯甲醇定容至1 mL，摇匀，得对照品贮备液。 储存于-20 ℃冰箱备用， 临用时再配制成为不同浓度梯度的混合工作液。

1.3.2 供试品溶液制备 采用甲醇直接提取法对绞股蓝提取物样品进行制备。 精密称取样品约0.2 g，置于50 mL 离心管中，加10 mL 75%甲醇水，2500 r/min 振摇30 min，50 kHz 超声30 min，8000 r/min、4 ℃离心5 min，过0.45 μm 有机相膜后，取上清1 mL 用蒸馏水定容至10 mL，作为绞股蓝提取液。

1.3.3 供试品溶液净化 将SPE 柱置于固相萃取系统上，活化：向SPE 柱中加入3 mL 甲醇，浸润后缓慢过柱弃流出液，再加入3 mL 蒸馏水，浸润后缓慢过柱弃流出液；上样：精密吸取0.5 mL待净化绞股蓝提取液至已活化的SPE 柱中，以2 ～3 滴/s 流速过柱，弃流出液；淋洗：依次加入2 mL蒸馏水，2 mL 20%乙腈，淋洗SPE 柱，弃淋洗液；洗脱：加入2 mL 40%乙腈，浸润后以2 ～3 滴/s流速过柱，收集洗脱液，待液相色谱测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化 比较Shimadzu Sum C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Kinetex C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）2 款不同色谱柱，发现在相同的条件下，2 种色谱柱都具有较好的分离度，但Kinetex C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分离条件较好，色谱图基线平稳，色谱峰峰形对称，出峰时间也相对缩短，节省实验周期。确定色谱柱后， 考察了30、35 ℃和40 ℃不同色谱柱柱温，发现当柱温为40 ℃时，目标化合物色谱峰与相邻色谱峰分离效果更好，能提前出峰时间。

2.2 前处理条件优化 本研究考察了甲醇、乙醇和水作为直接提取法的溶剂对绞股蓝皂苷含量测定的影响，结果表明甲醇的提取效果更好，这也与龙凌云（2018）等对绞股蓝皂苷前处理溶剂一致，并对甲醇水浓度（25%、50%、75%和100%）进行选择， 比较得75%甲醇水浓度具有最高提取率，结果如图2 所示。绞股蓝提取液中成分相对复杂，含有多种皂苷、黄酮、多糖等成分，在本实验选择了固相萃取柱对目标皂苷进行净化和富集。 首先以20 μg/mL 混合对照品为模型探究SPE 柱的淋洗和洗脱条件， 将SPE 柱先后使用3 mL 甲醇和蒸馏水活化，加入2 mL 混合对照品，以蒸馏水及20%、40%、60%、80%、100%乙腈水淋洗SPE 柱，收集洗脱液，进行液相检测。 结果表明，40%乙腈条件下，目标化合物洗脱完全，对照品经SPE 柱洗脱后，绞股蓝皂苷XLIX 的回收率达91.3%，绞股蓝皂苷A 的回收率达94.8%，结果证明SPE 柱对样品前处理的的净化效果良好，且回收率较高，这也与Chen 等 （2021） 对保健品中人参皂苷和Song 等（2020）对原人参二醇人参皂苷的试验结果相似。SPE 柱有一定柱容量，过载会出现柱穿透现象，即部分目标化合物也会随流动相流出（彭晓俊等，2013），实验确定了此SPE 柱下最适添加绞股蓝提取液体积为0.5 mL。

图2 不同比例甲醇水提取率比较

2.3 线性实验 用甲醇将溶剂配制成200 μg/mL混合标准使用液， 并逐级稀释至浓度梯度分别为0.1、0.5、1.0、2.5、10、25、50、100、200 μg/mL 混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。 以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。检出限为S/N=3 的值， 定量限为S/N=10 的值。 实验结果如表2所示， 绞股蓝皂苷XLIX 和绞股蓝皂苷A 在一定浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

表2 线性实验结果

2.4 精密度实验 按照“2.2.1” 项方法制备100 μg/mL 混合标准贮备溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定， 连续6 次进样， 参照峰为绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分别计算2 个峰的相对保留时间RSD 和相对峰面积RSD。 结果显示，两个峰相对保留时间的RSD 为0.01%和0.01%， 相对峰面积的RSD 为0.32%和0.31%， 表明高效液相色谱仪的精密度良好。

2.5 稳定性实验 按照“2.3.2”项方法制备绞股蓝（S1）提取液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别于0、24、48 h 进样分析， 参照峰为绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分别计算2 个峰的相对保留时间RSD 和相对峰面积RSD。 结果显示，两个峰相对保留时间的RSD 为0.04%和0.05%， 相对峰面积的RSD 为0.53%和1.27%， 表明本次试验制备的供试品溶液在48 h 内较稳定。

2.6 重复性实验 采用加标回收实验的绞股蓝提取液6 份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，参照峰为绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分别计算2 个共有峰的相对保留时间RSD 和相对峰面积RSD。 结果显示，两个峰相对保留时间的RSD 为0.07%和0.01%， 相对峰面积的RSD 为0.75%和0.60%，表明本次实验方法的重复性良好。

2.7 加标回收实验 精密称取绞股蓝供试品（S3），每份约0.2 g，分3 组，添加混合标准对照品的浓度水平为5、25 μg/mL 和200 μg/mL，每组6个平行，按“2.1”项下色谱条件进样测定，参照峰为绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 峰，记录峰面积，计算两种皂苷3 个水平加标回收率为91.38% ～98.4%，RSD 小于2.48%，实验结果如表3 所示，表明本实验方法回收率较好。

表3 加标回收率试验结果

2.8 样品含量测定 按“2.3.2”项分别对6 个样品进行制备，按“2.1”项下色谱条件进样测定，对从市面上购买的6 批样品进行测定， 结果表明样品S2、S3、S5 绞股蓝皂苷XLIX 和A 未检出，实验结果如表4 所示。

表4 含量测定结果 mg/g

实验测得的含量结果显示， 市场中购买的绞股蓝提取物中皂苷的含量差异较大， 质量参差不齐，这可能与绞股蓝不同的基原、品种和加工方式等有较大关系 （Zhang 等，2021；Zhang 等，2021；Dong 等，2018；Huang 和Yu，2000）， 绞股蓝的不同部位和生长时期对皂苷种类和含量也有影响（乐圆，2010），有待进一步进行研究。

4 结论

本实验前处理利用甲醇直接提取法和SPE柱净化目标化合物， 并使用HPLC-UV 对绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 进行准确的定量测定， 建立了SPE-HPLC-UV 检测方法。 本实验所建立的方法样品前处理简单、分析时间短、检测效率显著提高、其稳定性、精密度、重复性、线性关系良好，适用于绞股蓝提取物中对绞股蓝皂苷XLIX 和皂苷A 进行准确的定量。