基于网络药理学及动物实验研究温肾宣痹汤抗骨质疏松的机制

王海平,袁兆丰,夏天卫,张 超,沈计荣

(1. 南京中医药大学附属医院/江苏省中医院骨伤科,江苏 南京 210029;2. 盐城市大丰中医院骨伤科,江苏 盐城 224100)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是指由于多种原因导致的骨量和骨密度减低、骨小梁微结构损伤,易发生脆性骨折的一种全身性代谢性骨病[1]。OP是绝经后妇女及老年患者的常见病、多发病,容易引发脆性骨折而致残、致死,严重影响患者的健康,造成了严重的社会负担。据估计[2],到2035年我国OP相关骨折的年度数量将达到466万例,花费约1 300亿元;到2050年将达到599万例,花费约1800亿元;其中女性患者数量约占75%,所以对OP的治疗方法研究具有重大的现实意义。目前治疗OP西药包括双膦酸盐类、雌激素类、RANKL抑制剂等[1],常需联合用药,副作用大,费用高。中药、中成药治疗OP显示出独特优势,目前骨质疏松诊疗指南推荐的有骨碎补总黄酮、淫羊藿苷、人工虎骨粉等[1]。温肾宣痹汤(wenshen xuanbi tang,WSXBT)是江苏省中医院诸方受教授的名方,治疗OP疗效确切[3],为了研究WSXBT治疗OP的作用及机制,应用网络药理学和分子对接技术探索WSXBT治疗OP的有效成分及核心靶点,并用动物实验的方法进行验证,研究结果将进一步明确WSXBT治疗OP的作用机制,以期拓展其临床应用。

1 材料与方法

1.1 WSXBT治疗OP的网络药理学及分子对接

1.1.1筛选WSXBT成分及作用靶点 以“桂枝”、“细辛”、“附子”、 “甘草”、“木香”、 “白术”、“茯苓”、“薏苡仁”、“泽泻”、“山茱萸”为关键词,查询中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),并以口服生物利用度(OB)≥0.30,类药性(DL)≥0.18为条件获取药物活性成分及其所对应靶点。“狗脊”“天麻”活性成分来自Herb数据库(http://herb.ac.cn/),并用SwissAdme数据库(http://www.swissadme.ch/)进行分子筛选,筛选条件为“GI absorption 为High”, “Druglikeness”最少有三个“Yes”,筛选的有效成分用SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测,其中筛选条件为“Probability*≥0.10”。最后基于UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对靶蛋白进行标准化处理。

1.1.2筛选WSXBT治疗OP靶点 以“Osteoporosis”为检索词分别检索DisGenet (https://www.disgenet.org/home/)、OMIM(http: //www.omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、GEO(https://www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/)、MalaCards(https://www.malacards.org/)数据库,并对潜在靶点做并集,获得OP疾病靶点。WSXBT药物靶点与OP疾病靶点交集作为WSXBT治疗OP的潜在靶点。

1.1.3PPI网络的构建及核心靶点的筛选 将1.1.2项中获取的潜在靶点输入STRING(https://cn.string-db.org)数据库,以“Homo sapiens”、“置信度≥0. 90”为条件制作PPI网络,并利用Cytoscape软件进行可视化,通过2倍平均度值(degree)、一倍的中介中心度值(betweenness centrality)、一倍的紧密度值(closeness centrality)筛选出23个核心靶点。

1.1.4生物功能注释与通路富集分析 通过Metascape(https://metascape.org)数据库对WSXBT治疗OP的核心网络靶标进行GO生物学分析,研究其靶点的生物过程; 进一步利用KEGG通路富集分析,探究WSXBT核心靶标干预OP的重要信号通路。

1.1.5构建药物-成分-靶点-疾病互作网络 将1.1.2中获得的潜在靶点与作用于潜在靶点的有效成分构建药物-成分-靶点-疾病互作网络,并通过“Degree”筛选出关键成分。

1.1.6分子对接 关键化合物槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、异补骨脂黄酮(isobavachin)、β-谷甾醇(sitosterol)、甘草查耳酮A(licochalcone a)、豆甾醇(stigmasterol)、儿茶精[(+)-catechin]、隐品碱(cryptopin)、芝麻素(sesamin)等 2D结构从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取,并运用Chem3D 19.0软件把2D结构转化为3D结构;在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取 PIK3R1(5gji)、AKT1(1unq)核心靶点3D结构,并利用PyMOL 2. 2. 0软件去除其配体及水分子;最后利用AutoDockTools 1.5.7软件将关键化合物配体与核心靶点受体进行对接。

1.2 WSXBT治疗OP的实验研究

1.2.1动物 SD大鼠,SPF级,♀,体质量170～230 g,生产许可证号SCXK(浙)2019-0001,使用许可证号 SYXK(苏)2021-0040,由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供。伦理审查批准编号 IACUC-20220711-01,动物饲养于江苏省药物研究所有限公司屏障系统内。

1.2.2主要药物试剂与仪器 WSXBT方剂购于江苏省中医院,方药组成:狗脊10 g(批号:22021508)、附子10 g(批号:2205091)、细辛6 g(批号:220503)、山茱萸10 g(批号:20220603)、桂枝10 g(批号:20221202-02)、木香10 g(批号:20220401-01)、天麻10 g(批号:20220401-03)、茯苓12 g(批号:20220202-01)、泽泻10 g(批号:20220601-01)、薏苡仁15 g(批号:20220601-02)、白术10 g(批号:220601)、甘草10 g(批号:220501)。阿仑膦酸钠片(福善美)70 mg/片(杭州默沙东制药有限公司,批准文号:国药准字J20130085),异氟烷(河北金达福药业有限公司 批准文号:兽药字031217015),PI3K抗体、p-PI3K抗体、AKT抗体、p-AKT抗体(abcam公司,ab191606、ab182651、ab179463、ab192623),β-actin抗体(Bioswamp,MAB48206),辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(Lot.A0216)、山羊抗兔IgG(BIOMIKY,MK103A),骨保护素(OPG)、核因子kb受体活化因子配体(RANKL)、Ⅰ型前胶原氨基端肽(PINP)Elisa试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司,Cat.No:RA20507、RA20750、RA20172)。动物麻醉机(上海塔望生物科技有限公司,型号:AM-1005A),冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司,设备编号:APP-SAM-064),电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司, 设备编号:APP-GEN-008),光吸收读板机(Molecular Devices,设备编号:APP-SAM-046),洗板机(Thermo Fisher,设备编号:APP-TOX-039),力学测试仪(MTS Acumen), Micro-CT影像系统(厂家:德国Bruker公司,型号:SkyScan 1176),轮转式切片机(厂家:Leica,型号:RM2235),烘片机(厂家:Leica,型号:HI1220)。

1.2.3分组、造模、给药及取材 36只SD大鼠随机分为6组: 假手术组(Sham)、模型组(OVX) 、阿仑膦酸钠组(ALN)、温肾宣痹方低剂量组(WSD)、温肾宣痹方中剂量组(WSZ)、温肾宣痹方高剂量组(WSG),每组6只。选用异氟烷吸入式麻醉,麻醉成功后取俯卧位,固定大鼠,于背部正中线旁开约1 cm处作约2 cm纵行切口,切除卵巢,缝合皮下组织及皮肤。假手术组采用相同手术方法,仅切除卵巢周边等量的脂肪组织。造模成功后进行药物灌胃干预,温肾宣痹方高剂组予22.14 g·kg-1·d-1,中剂量组予11.07 g·kg-1·d-1,低剂量组予5.54 g·kg-1·d-1,阿仑膦酸钠组给予6.25 mg·kg-1·w-1阿仑膦酸钠,假手术组及模型组给予等量生理盐水,连续灌胃12周。12周后禁食12 h麻醉大鼠,打开腹腔,暴露腹主动脉,行腹主动脉采血约5～10 mL,促凝离心管中静置后经离心得血清,置于-80 ℃保存。分离大鼠双侧股骨及胫骨,去除骨组织周围软组织。

1.2.4血清中OPG、RANKL、PINP指标检测 取冻存血清室温解冻,按照 ELISA 试剂盒说明书进行操作,检测血清中OPG、PINP、RANKL因子含量。

1.2.5Micro-CT检测 采用 Micro-CT技术检测大鼠左股骨组织微结构及骨密度变化。应用德国Bruker公司生产的微CT成像系统进行扫描,空间分辨率为9 μm。然后分别用内置软件DataViewer观察股骨三视图、CTvox进行三维重建和CTAn计算骨密度及骨小梁参数。

1.2.6股骨生物力学检测 通过骨科生物力学测试仪测定大鼠左侧股骨生物力学,将股骨水平放置在测试仪的两个支撑点上,跨度为20 mm,探头作用于股骨中点处,下压速度为0.02 mm·s-1直至其断裂,分析出最大载荷、弹性载荷等指标。

1.2.7胫骨组织病理学检测 大鼠胫骨用福尔马林(0.10)室温固定3 d, EDTA(0.10)脱钙,冠状面切片,层厚为4 μm,依次苏木精、伊红染色,封片,镜检。

1.2.8PI3K/Akt通路蛋白检测 提取大鼠右侧股骨组织总蛋白,测定蛋白浓度,以40 μg总蛋白进行上样电泳,转膜,在Western blot快速封闭液中室温孵育20 min封闭非特异性结合位点,加入 PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,相应的二抗孵育1 h后TBST洗膜,滴加ECL发光试剂显影。

2 结果

2.1 WSXBT治疗OP的网络药理学和分子对接结果

2.1.1WSXBT治疗OP疾病潜在靶点的筛选 从WSXBT中共筛选出156个活性成分,靶点550个。OP疾病靶点从DisGenet数据库中收集到1 149个,OMIM数据库中46个,GeneCards数据库中1 373个,GEO数据库中304个,MalaCards数据库中853个,对潜在靶点做并集,共获得3 085个疾病靶点。将WSXBT药物靶点与OP疾病靶点做交集,筛选到WSXBT治疗OP的潜在靶点229个。

2.1.2PPI及“药物-成分-疾病-靶点”网络图构建 利用Cytoscape 3.9.1软件根据Degree从大到小进行筛选,Degree较高的可作为核心靶点,筛选出STAT3、PIK3R1、RELA、AKT1、PIK3CA等23个核心靶点,运用Cytoscape 3.9.1软件展现核心靶点互作图(Fig 1)。WSXBT治疗OP的潜在靶点229个,作用于潜在靶点的活性成分144个,另外12个活性成分舍弃,构建“药物-成分-靶点-疾病” 网络图,筛选出核心成分包括槲皮素、异补骨脂黄酮、β-谷甾醇等。

Fig 1 PPI network map of core targets

2.1.3GO功能注释及KEGG通路分析 WSXBT治疗OP的核心靶点在Metascape数据库中进行GO富集分析,以“PValue Cutoff”为0.01、“Min Enrichment”为1.5为筛选条件,得到生物过程、细胞组分和分子功能模块相关条目分别为773、31和57个,根据“Enrichment”度分别选取前10进行展示(Fig 2),有显著性的功能包括一氧化氮合酶调节活性、丝裂原活化蛋白激酶活性、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、配体激活的转录因子活性等。KEGG通路富集分析共发现145条信号通路,选取前 20个相关的信号通路进行展示(Fig 3),包括PI3K/Akt 信号通路、缺氧诱导因子1信号通路 、破骨细胞分化信号通路、雌激素信号通路等。

Fig 2 GO function enrichment analysis

Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis

2.1.4分子对接 对PI3K、Akt核心靶点与槲皮素、异补骨脂黄酮、β-谷甾醇等关键成分进行分子对接,结合能是分子之间结合所需要的能量,负值代表自然状态下可以结合,负值越小越容易结合,一般认为结合能≤-5.0 kJ·mol-1有较好结合活性且较稳定[4],具体结合能见(Tab 1),对部分分子对接结合示意图进行展示(Fig 4)。

2.2 WSXBT对OP大鼠的影响

Tab 1 Molecular docking results

2.2.1WSXBT对血清中OPG、RANKL、PINP的影响 如Tab 2所示,与Sham组比较,OVX组大鼠血清中 OPG 、PINP、OPG /RANKL水平明显降低,RANKL水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与 OVX组比较,WSZ、WSG组大鼠血清中 OPG水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),WSD、WSZ、WSG、ALN组大鼠血清中PINP水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与 OVX组比较,WSZ、WSG、ALN组大鼠血清中 RANKL水平降低, OPG/RANKL水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。

Tab 2 Comparison of OPG, RANKL and PINP levels in serum of rats in each group

2.2.2WSXBT对骨密度及骨组织微结构的影响 如Fig 5所示,Micro-CT二维结构及三维结构显示,WSXBT可明显提高大鼠密度,同时改善骨组织微结构。与OVX组比较,其中ALN组及WSG组骨密度(bone mineral density,BMD)明显提高,差异有统计学意义(P<0.01),WSD及WSZ组骨密度提高,差异有统计学意义(P<0.05);与OVX组比较,ALN组及WSZ、WSG中药组可提高骨小梁数(trabeculae number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabeculae thickness,Tb. Th)、骨体积/组织体积(bone volume/tissue volume, BV/TV),降低小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)。

2.2.3WSXBT对股骨生物力学的影响 与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠股骨弹性载荷及最大载荷明显降低(P<0.01);与OVX组相比,ALN组大鼠股骨弹性载荷及最大载荷明显升高(P<0.01),给予WSXBT后,WSZ、WSG组大鼠股骨弹性载荷及最大载荷明显升高(P<0.01),表明WSXBT可以改善大鼠生物力学性能(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of elastic load and maximumload in each group

Fig 4 Schematic diagram of molecular docking results

Fig 5 Two-dimensional structure and three-dimensional structure of rats femur Micro-CT

2.2.4WSXBT对胫骨组织病理学的影响 胫骨近端冠状位HE染色结果显示(黑色箭头所示为骨骺线):Sham组骨小梁分布均匀、致密,骨髓中脂滴极少,骨小梁连续且连接成网状;OVX组骨小梁断裂,分布杂乱、稀疏,相互分离,髓腔内见大量脂滴聚集; 与OVX组相比,WSD、WSZ组骨小梁排列较整齐,骨小梁稀疏、断裂好转,髓腔内脂滴减少;与OVX组相比,WSG及ALN组骨小梁数量明显增加,厚度明显提高,排列均匀,骨小梁间距缩小,并且髓腔内脂滴聚集明显变少(Fig 6)。

Fig 6 Pathological morphology of femoral tissues of rats (×40)

Fig 7 Protein expression of p-PI3K, p-Akt, PI3K, Akt in rat femoral *P<0.05,**P<0.01 vs Sham; #P<0.05,##P<0.01 vs OVX.

2.2.5WSXBT对骨组织中PI3K、Akt蛋白的影响 如Fig 7所示,与Sham组比较,OVX组大鼠骨组织中p-PI3K和 p-Akt蛋白表达水平降低(P<0.05);与OVX组比较,WSZ、WSG组大鼠骨组织中p-PI3K和 p-Akt蛋白表达水平升高(P<0.05)。

3 讨论

OP是中老年人特别是绝经后妇女的一种常见病、多发病,因其发病率高,容易并发骨质疏松性骨折[5],致残率、致死率高,因此,预防和治疗OP具有重要的临床意义。OP属中医“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”范畴,其病因病机多与肝肾亏虚、气血瘀滞、脾肾不足等相关。绝经后骨质疏松患者多有肾阴虚症状,但阴阳互根互用,互相转化,阴虚日久常常导致阳虚,而肾阳是人体命门之火,肾精得命门之火的温养才能够发挥其滋养的作用,脾胃需要命门之火的温煦才能够发挥其运化水谷而生后天之精的功能。诸方受教授认为骨质疏松患者常常伴随脾肾阳气亏虚,阳虚则津液运化失常,寒湿痹阻经络,疼痛乃生。WSXBT中附子、山萸肉、细辛、狗脊及桂枝温补肝肾;白术、薏苡仁、茯苓、泽泻健脾除湿;木香、天麻行气除痹止痛;全方补中有泻、肝脾肾同补、扶正去邪、标本兼治,对3种类型OP都有一定的疗效,临床上临证加减治疗OP疗效确切。

本实验中阿仑膦酸钠组及中药组大鼠骨密度升高,骨组织微结构、组织病理学明显改善,血清中PINP水平升高,OPG/RANKL水平降低。Ⅰ型胶原是矿化骨中唯一的胶原类型,PINP是Ⅰ型胶原产生时切下来的氨基端末端肽,是骨形成的特异性标志物之一,且受昼夜变化及饮食影响最小[6-7]。绝经后OP患者失去了雌激素对RANKL的抑制作用,导致RANKL诱导的破骨细胞生成增加,破骨增加,导致OP,而OPG可以与RANKL竞争其受体RANK,减少破骨细胞的生成,OPG/ RANKL比值在破骨细胞分化中具有重要的作用[8-9]。 提示WSXBT可能通过促进骨形成,提高OPG/RANKL比值抑制破骨细胞的生成来达到抗OP的目的。

本研究通过网络药理学得到WSXBT共有156个药物活性成分,综合分析得到WSXBT治疗OP的关键成分包括槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芝麻素等。研究发现槲皮素通过升高Bcl-2、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K的表达,明显逆转柠檬酸铁铵对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用[10]。柚皮素是狗脊及甘草的共有活性成分,研究显示柚皮素可降低超氧化物歧化酶、丙二醛等超氧化物歧化酶水平,升高血清中护骨素和股骨组织中PI3K蛋白表达水平,明显改善OP大鼠骨密度[11]。β-谷甾醇是附子、桂枝、木香、山茱萸、薏苡仁、泽泻、甘草共有成分,研究发现β-谷甾醇具有抗菌、抗炎、抗氧化、降脂、调节骨代谢等多种生物学作用[12]。芝麻素是细辛的活性成分,有研究显示芝麻素可升高去卵巢骨质疏松大鼠骨钙素和Ⅰ型胶原表达,促进骨重塑,有明显的抗骨质疏松作用[13]。提示WSXBT可能是通过槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芝麻素等活性成分治疗OP。

进一步通过对WSXBT治疗OP的作用靶点的PPI分析、GO 分析和 KEGG 通路分析,筛选核心靶点有STAT3、PIK3R1、AKT1、RELA、PIK3CA等。分子功能与蛋白激酶结合、转录因子结合、磷酸酶结合、蛋白丝氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶结合等相关;KEGG通路富集分析主要有PI3K-Akt信号通路、雌激素信号通路、NF-kappa B信号通路、破骨细胞分化信号通路等。核心靶点PIK3R1、Akt1是PI3K-Akt信号通路上重要的节点,对成骨细胞、破骨细胞都有重要的调节作用,与OP关系密切[14-15]。人工虎骨粉是骨质疏松诊疗指南中推荐用药[1],研究显示可以激活PI3K/Akt通路促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖、分化和矿化来促进成骨,抑制其凋亡[16]。牡荆素可以通过促进PI3K、Akt和内皮细胞NO合成酶(eNOS)的磷酸化增强内皮细胞的迁移和管的形成,对缺氧处理的EAhy926细胞有保护作用,修复OP大鼠骨损伤,促进成骨细胞的生化指标和血管生成指标[17]。分子对接显示,PIK3R1、AKT1与关键成分槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等对接能量全部小于-5 kJ·mol-1,表示关键成分与核心靶点结合比较稳定,提示WSXBT可能是通过上述关键活性成分靶向PIK3R1、AKT1等核心靶点达到抗OP的目的。本研究通过实验验证发现与假手术组比较,模型组大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明显降低;与模型组大鼠比较,WSZ、WSG组大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明显升高,提示WSXBT可能通过PI3K/Akt通路改善绝经后骨质疏松大鼠骨密度;阿仑膦酸钠属于双膦酸盐类抗骨质疏松药物,其抗骨质疏松主要通过抑制破骨细胞功能,从而抑制骨吸收,所以与模型组比较,阿仑膦酸钠组大鼠PI3K/Akt通路蛋白无明显升高。

综上,本研究借助网络药理学及分子对接技术,初步探得WSXBT治疗OP的机制,动物实验验证WSXBT可提高骨质疏松大鼠骨密度,加强骨组织生物力学性能,逆转骨小梁破坏等病理损伤。其机制可能是通过提高OPG/RANKL比值及激活PI3K/Akt通路来达到抗骨质疏松的目的。本实验仍有其局限性,动物实验只验证了部分核心靶点,不够全面,再者未进行细胞实验进一步探究WSXBT对成骨、破骨细胞的影响,这将是今后课题组团队研究的方向,进一步探究WSXBT治疗OP的作用机制,为其临床运用提供科学依据与新的思路。