离子交换色谱-紫外检测器法测定马铃薯中马来酰肼的残留量

王晓威,孟玲玲,蔡丹旎,于世强,刘鹏宇,栾绍嵘

(华东理工大学 化学与分子工程学院,上海 200237)

据联合国粮食及农业组织(FAO)统计,我国是马铃薯种植面积最大的国家,种植面积稳定在8 000万亩以上,全国马铃薯鲜薯产量达一亿吨。在马铃薯贮藏过程中为防止其发芽、变绿,常在马铃薯收获的前2～4周内,用0.2%(质量分数)马来酰肼(MH)溶液进行叶面喷洒。MH又名抑芽丹,是一种植物生长抑制剂,能有效抑制植株顶端分生组织细胞分裂,破坏植株顶端优势,强烈抑制芽的生长,常被用于抑制马铃薯、洋葱、大蒜等蔬菜贮藏期的发芽。研究发现,MH是一种诱变致癌剂,一定剂量下会导致细胞染色体断裂,从而产生细胞毒性,对人和高等动物有潜在风险[1]。据中国马铃薯协会统计,中国人均食用马铃薯消费量为31.3 kg·a-1,日均消费量为85.75 g·d-1。因此,建立马铃薯中MH残留的简便、快速的检测方法已成为保障人民身体健康的迫切需求。

目前,MH残留的检测方法主要有蒸馏-分光光度法[2-3]、高效液相色谱法(HPLC)[4-6]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[7-11]、气相色谱法[12]、毛细管电泳法[13]、拉曼光谱法[14]、化学发光法[15-17]、差分脉冲伏安法[18]等。较为常见的是前3种方法,其中蒸馏-分光光度法是美国分析化学家协会(AOAC)最初采用的方法,其依赖MH在浓碱及高温条件下被锌还原成肼,同时用氮气保护,将生成的肼蒸馏出来,在酸性溶液中与对二甲基氨基苯甲醛反应生成黄色化合物,再用分光光度法进行检测。该过程需要浓碱、高温条件,以及蒸馏等步骤,前处理复杂,操作繁琐,导致方法重复性不好。HPLC检测灵敏度较差,若想达到较低的检出限,则需要浓缩、复溶等一系列复杂的前处理手段。LC-MS/MS检测MH虽有较高的灵敏度,但仪器成本高,难以作为常规检测手段。根据MH的化学结构,它在弱酸性、碱性条件下呈阴离子状态,并且具有紫外吸收,因此可采用带有紫外检测器的离子色谱法进行分析检测。例如,文献[19]采用高效离子排斥色谱法测定了蔬菜样品中MH的残留量,达到了较理想的结果;文献[20]在此基础上优化了淋洗液浓度和流量,并利用此方法考察了MH在马铃薯块茎及芽叶中的分布情况,结果表明马铃薯块茎中的MH会定向向芽叶中迁移并积累,且不同品种马铃薯中MH的迁移能力有差异。

鉴于此,本工作提出了离子交换色谱-紫外检测器法测定马铃薯中MH残留量的方法。相较于蒸馏-分光光度法、HPLC等传统检测方法,该方法前处理简单,更易于推广为常规检测方法;相较于离子排斥色谱法,该方法更加通用,同时流动相避免了有机溶剂的引入,符合绿色环保的理念,且流动相由KOH淋洗液发生器在线产生,不仅基线噪声更低,还避免了手动配制流动相产生的误差及二氧化碳的影响,有效提高了方法的精密度和稳定性。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-6000型离子色谱仪,配UltiMate 3000 VWD可变波长检测器、KOH淋洗液发生器、自动进样器和Chromeleon 7.2.10色谱工作站;Xevo G2 TOF型质谱仪;Milli-Q型超纯水机。

MH标准储备溶液：称取0.051 2 g MH标准品,用50%(体积分数)甲醇溶液溶解(超声辅助)并定容至50 mL,摇匀,配制成MH质量浓度为1 014 mg·L-1的标准储备溶液。使用时,用水稀释至所需质量浓度。

MH标准品的纯度大于99%;甲醇为色谱纯;氢氧化钠为优级纯;试验用水为超纯水(电阻率不小于18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

Dionex IonPac AS16分析柱(250 mm×4 mm,9 μm),Dionex IonPac AG16保护柱(50 mm×4 mm,9 μm);柱温30 ℃;流量1.0 mL·min-1;进样量25 μL;紫外检测波长205 nm。流动相为KOH溶液,梯度洗脱程序：0～7.0 min,KOH溶液浓度为3 mmol·L-1;7.0～7.1 min,KOH溶液浓度跳转至30 mmol·L-1,保持17.9 min;25.0～25.1 min,KOH溶液浓度跳转至3 mmol·L-1,保持4.9 min。

1.3 试验方法

本工作分析的市售马铃薯均未检出MH,因此将马铃薯浸泡在MH标准溶液中可简单模拟MH残留的马铃薯样品。将马铃薯洗净,切成约1 cm厚度的厚片,浸泡于500 mg·L-1MH标准溶液中,再置于2～8 ℃冰箱中放置24 h。24 h后取出,洗净、去皮、搅碎。称取1 g处理后的样品于15 mL离心管中,加入10 mL甲醇,超声30 min,每隔5 min振摇1次,使样品分散均匀,然后于60 ℃水浴加热5 min,室温下以转速5 000 r·min-1离心20 min,上清液过0.22 μm聚醚砜针式滤器和IC-RP反相前处理柱,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

试验采用阴离子交换色谱柱,流动相为碱性溶液,若提取溶剂选择不当,不仅会影响提取效率,还会影响待测物的保留时间和检测结果。试验考察了含20 mmol·L-1氢氧化钠的甲醇溶液、20 mmol·L-1氢氧化钠溶液、水以及甲醇分别作为提取溶剂时模拟马铃薯样品中MH的测定值,结果如图1所示。

图1 提取溶剂对MH测定值的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on the determined values of MH

由图1可知,以甲醇和含20 mmol·L-1氢氧化钠的甲醇溶液为提取溶剂时,MH测定值分别为44.19 μg·g-1和45.37 μg·g-1,略高于以20 mmol·L-1氢氧化钠溶液和水为提取溶剂时的(MH测定值分别为36.23 μg·g-1和34.90 μg·g-1)。考虑到加入碱会影响溶液酸度,从而影响待测物的出峰时间,试验选择以甲醇为马铃薯中MH的提取溶剂。

2.2 仪器工作条件的选择

2.2.1 淋洗液发生器的使用

阴离子交换色谱柱的流动相可通过KOH淋洗液发生器在线产生,也可用手动配制的NaOH溶液。试验考察了这两种方式的流动相对MH检测的影响,淋洗液发生器采用的流动相为3 mmol·L-1KOH溶液,手动配制的流动相为3 mmol·L-1NaOH溶液,结果如图2所示。

图2 淋洗液发生器与手动配制流动相对MH检测的影响Fig.2 Effects of eluent generator and hand-made mobile phase on the determination of MH

结果表明,采用KOH淋洗液发生器的基线噪声比采用手动配制NaOH溶液的小。这是由于NaOH溶液在手动配制过程中会吸收空气中二氧化碳,对基线造成一定的影响,而淋洗液发生器可实时制备出较为纯净的KOH溶液,避免了杂质干扰。因此,试验采用KOH淋洗液发生器提供流动相。

2.2.2 色谱柱

试验考察了Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC、Dionex IonPac AS15和AG15、Dionex IonPac AS16和AG16、Dionex IonPac AS18和AG18以及Dionex IonPac AS19和AG19等5种色谱柱(前者为分析柱,后者为保护柱)对模拟马铃薯样品中MH色谱峰的影响,结果见图3。

图3 不同色谱柱检测模拟马铃薯样品中MH的色谱图Fig.3 Chromatograms of MH in the simulated potato sample determined by different chromatographic columns

结果表明：采用Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC色谱柱分离时(流动相为1 mmol·L-1KOH溶液), 基线不稳定, 且MH出峰前出现保留时间为12.75 min的未知峰(由于含量太少,图中未能显示),与MH的分离度为1.22,小于1.5,不适用于MH的分离检测;采用Dionex IonPac AS19和AG19色谱柱分离时(流动相为5 mmol·L-1KOH溶液),MH显示为倒峰,可能是由于模拟样品中有其他物质与MH在同一位置出峰,且在205 nm检测波长下的吸光度比基线小,不宜用于MH的检测;Dionex IonPac AS15和AG15(流动相为10 mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS16和AG16(流动相为3 mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS18和AG18(流动相为5 mmol·L-1KOH溶液)色谱柱均可较好地分离MH,但Dionex IonPac AS16和AG16色谱柱得到的MH色谱峰峰高相对较高,半峰宽相对较小,对称性较好。因此,试验选用Dionex IonPac AS16和AG16色谱柱进行检测。

2.2.3 洗脱程序

试验考察了KOH溶液浓度分别为3,4,5 mmol·L-1时模拟马铃薯样品中MH的分离情况,结果见图4。

图4 KOH溶液浓度对MH分离的影响Fig.4 Effect of the concentration of KOH solution on the separation of MH

结果表明,当KOH溶液浓度由5 mmol·L-1降低至3 mmol·L-1时,MH色谱峰与前面未知峰的分离度逐渐增加,其中3,4 mmol·L-1KOH溶液得到的MH分离度(1.99,1.68)均满足大于1.5的要求。鉴于3 mmol·L-1KOH溶液得到的MH分离度更好,且保留时间也比较合理,试验选择以3 mmol·L-1KOH溶液分离MH。MH洗脱分离后,立即将KOH溶液浓度升至30 mmol·L-1来冲洗杂质,最后再将KOH溶液浓度降至3 mmol·L-1平衡系统。

2.3 系统适用性

按照仪器工作条件分别对空白溶液(不添加马铃薯样品,其余前处理步骤同1.3节)、未浸泡MH的样品溶液(马铃薯直接去皮、搅碎后处理,其余前处理步骤同1.3节)以及2.028 mg·L-1MH标准溶液进行测定,考察MH的干扰情况,结果见图5。

图5 系统适用性考察Fig.5 Investigation of the system suitability

由图5可知,空白溶液和未浸泡MH的样品溶液中均未出现干扰MH的物质,说明该方法对马铃薯中MH的检测不存在干扰。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检出限和测定下限

取10,20,50,80,100 μL 1 014 mg·L-1MH标准储备溶液,用水定容至10 mL,摇匀,即得质量浓度分别为1.014,2.028,5.070,8.112,10.14 mg·L-1的MH标准溶液系列;分取360 μL 5.070 mg·L-1MH标准溶液,用水定容至10 mL,摇匀,即得质量浓度为0.182 5 mg·L-1的MH标准溶液。按照仪器工作条件对上述6个浓度水平的MH标准溶液进行测定,以MH质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标进行线性回归。结果表明：MH标准曲线的线性回归方程为y=2.194x-0.064 24,相关系数为0.999 9,线性范围为0.182 5～10.14 mg·L-1。

分别以3,10倍信噪比(S/N)确定检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果分别为0.06 mg·L-1和0.18 mg·L-1。

2.4.2 仪器精密度和重复性试验

将2.028 mg·L-1MH标准溶液按照仪器工作条件测定6次,结果显示,MH的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.073%,3.7%,表明仪器稳定,精密度较好。

摘 要：新时代教育工作的开展，必须保持积极的创新思路，不能继续按照老旧的灌输式方法来完成。从客观的角度分析，小学数学教育信息化的应用，已经得到了业界的高度肯定，同时能够在教育的可靠性、可行性方面获得良好的提升，针对未来教育的进步，能够奠定坚实的基础，在师生素质的共同提升方面，均能够产生良好的推动作用。因此，研究在教育信息化背景下具体的小学数学教学策略，能为教学指出更明确的方向。

取同一模拟马铃薯样品,按照试验方法平行处理6份并测定,结果显示,MH的保留时间、测定值和峰面积的RSD分别为0.15%,3.8%,3.4%,表明本方法重复性较好。

2.4.3 稳定性试验

将2.082 mg·L-1MH标准溶液及模拟马铃薯样品溶液在室温下放置,于0,6,12,18,24 h分别进行测定。结果显示：标准溶液中MH的保留时间和峰面积的RSD分别为1.6%,2.2%,模拟马铃薯样品溶液中MH的保留时间和峰面积的RSD分别为1.3%,1.8%,说明24 h内MH的稳定性良好。

2.4.4 耐用性试验

试验考察了柱温、流量和检测波长这3个参数的耐用性。

改变柱温为28 ℃和32 ℃,其他条件不变,对2.082 mg·L-1MH标准溶液测定6次,对模拟马铃薯样品溶液测定1次。结果表明：当柱温为28,32 ℃时,MH色谱峰与未知峰的分离度分别为1.91和2.10,均满足分离度大于1.5的要求;6次测定的MH峰面积的RSD分别为4.0%和4.4%,精密度较好,说明柱温为(30±2)℃时对MH的检测没有影响。

改变流量为0.9 mL·min-1和1.1 mL·min-1,其他条件不变,对2.082 mg·L-1MH标准溶液测定6次,对模拟马铃薯样品溶液测定1次。结果表明：当流量为0.9,1.1 mL·min-1时,MH色谱峰与未知峰的分离度分别为1.95和2.03,均满足分离度大于1.5的要求;6次测定的MH峰面积的RSD分别为3.1%和4.1%,精密度较好,说明流量为(1.0±0.1)mL·min-1时对MH的检测没有影响。

2.4.5 回收试验

在模拟马铃薯样品中加入MH本底值80%,100%,120%的MH标准品,即分别加入22,28,33 μL 1 014 mg·L-1MH标准储备溶液,每个浓度水平平行加标3次,按照试验方法进行处理和测定,计算回收率,结果如表1所示。

表1 回收试验结果

由表1可知：MH回收率为97.9%～108%,表明本方法的准确度较高。

2.5 样品分析

随机从4个商家购买4份马铃薯样品,按照试验方法分析其中MH的残留情况。结果显示,马铃薯样品中均未检出MH(残留量均低于检出限),远低于GB 2763-2019 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定的马铃薯中MH的最大残留量(50 μg·g-1)。

本工作提出了离子交换色谱-紫外检测器法测定马铃薯中MH残留量的方法,该方法分析快速,准确度高,重复性和稳定性均较好,可作为马铃薯中MH残留检测的通用方法,并可推广到其他农产品如大蒜、洋葱中MH的检测和质量控制。