基于化学激活荧光素酶表达基因法和标准方法评估动物源性固态食品中17种二英类化合物毒性当量的相关性比较

王 燕,张 敏,朱晓艳,江玲丽,王如坤,钟莺莺,谭 曜,保琦蓓*

(1.宁波海关技术中心,宁波 315012;2.南京海关危险货物与包装检测中心,常州 213000;3.宁波卫生职业技术学院,宁波 315100)

目前同位素稀释-高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRMS)被认为是二英类化合物检测的金标准(GB 5009.205-2013《食品安全国家标准 食品中二英及其类似物毒性当量的测定》),但是由于该方法检测费用高、周期长等原因,限制了其在批量样品检测中的应用,再加上设备昂贵也使得能开展此项检测的实验室较少。随着生物技术的发展,一些特异性强、灵敏度高、操作简单且分析时间短的生物技术,如酶联免疫法(EIA)、酶活力诱导法(EROD)、化学激活荧光素酶表达基因法(CALUX)等被用于快速筛查样品中二英类化合物。CALUX是基于二英类化合物产生的毒性作用需要与机体细胞核内的二英反应增强子结合,诱导机体内特异基因表达而构建CALUX系统,根据系统合成的荧光素量、荧光强度与系统中二英类化合物浓度水平的关系来评估其毒性[1]。CALUX作为美国国家环境保护局(EPA)批准的一种生物检测方法[SW 846-4435MethodforToxicEquivalents(TEQS)DeterminationforDioxin-LikeChemicalActivitywiththeCALUXBioassay],被应用于大量环境样品中的二英类污染物的筛查。目前也有很多将CALUX应用于土壤、水、烟气、污泥、饲料、添加剂以及生物组织中二英类化合物快速筛查的研究[2-8]。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

XPE205型电子天平;ASE350型加速溶剂萃取仪;Thermo DFS型高分辨气质联用仪;UV-1800型紫外-可见分光光度计;KA RV8型旋转蒸发仪;MD 200型氮吹仪;MCO-18AC型二氧化碳培养箱;CKKX53型显微镜;SW-CJ-1FD型生物安全柜;Centro XS3 IB960型化学发光读板机。

17种PCDD/Fs的混合标准溶液系列：2,3,7,8-TCDD、2,3,7,8-四氯代二苯并呋喃(2,3,7,8-TCDF)的质量浓度为0.5,2.0,10,40,200 ng·mL-1,1,2,3,7,8-五氯代二苯并对二英(1,2,3,7,8-PeCDD)、1,2,3,7,8-五氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8-PeCDF)、2,3,4,7,8-五氯代二苯并呋喃(2,3,4,7,8-PeCDF)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并对二英(1,2,3,4,7,8-HxCDD)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并对二英(1,2,3,6,7,8-HxCDD)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并对二英(1,2,3,7,8,9-HxCDD)、1,2,3,4,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8-HxCDF)、1,2,3,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,7,8,9-六氯代二苯并呋喃(1,2,3,7,8,9-HxCDF)、2,3,4,6,7,8-六氯代二苯并呋喃(2,3,4,6,7,8-HxCDF)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并对二英(1,2,3,4,6,7,8-HpCDD)、1,2,3,4,6,7,8-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,6,7,8-HpCDF)、1,2,3,4,7,8,9-七氯代二苯并呋喃(1,2,3,4,7,8,9-HpCDF)的质量浓度为2.5,10,50,200,1 000 ng·mL-1,八氯代二苯并对二英(OCDD)、八氯代二苯并呋喃(OCDF)的质量浓度为5.0,20,100,400,2 000 ng·mL-1,溶剂为壬烷。

同位素标记的混合内标溶液：13C标记的17种PCDD/Fs,质量浓度均为100 ng·mL-1。

回收率内标溶液：13C-1,2,3,4-TCDD和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD的质量浓度均为200 ng·mL-1。

正己烷、甲苯、二氯甲烷、甲醇、壬烷均为色谱纯。

从超市收集24份城市居民日常消费的动物源性固态食品,包括肉类9份(牛肉、猪肉、鸡肉各3份),海鲜类9份(鲫鱼、鲈鱼、鱿鱼各3份,去除内脏,取带皮可食肉质部分),配方乳粉6份,样品处理前先将其均质化并冷冻干燥成粉末,于-20 ℃储存。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

DB-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流进样;载气流量1.0 mL·min-1;进样口温度280 ℃,传输线温度310 ℃。柱升温程序：初始温度140 ℃,保持1 min;以20 ℃·min-1速率升温至200 ℃,保持1 min;以5 ℃·min-1速率升温至220 ℃,保持16 min;以5 ℃·min-1速率升温至235 ℃,保持7 min;以5 ℃·min-1速率升温至310 ℃,保持10 min。

1.2.2 质谱条件

电子轰击离子源,离子源能量45 eV,离子源温度260 ℃;接口温度270 ℃;以全氟煤油(PFK)为质量校正物质,质谱分辨率大于10 000;选择离子监测模式检测。其他质谱参数参考GB 5009.205-2013附录C中的表C.3。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的提取与净化

将1片乙酸纤维素膜放入萃取池底部,加入约10 g硅藻土,填充均匀后加入4～5 g样品,再在样品上部加入少量硅藻土并留出部分间隙,然后加入10 μL同位素标记的混合内标溶液(CALUX测定时不加)和1片乙酸纤维素膜,盖上盖子,以体积比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液为萃取剂,在150 ℃和10.3 MPa条件下萃取10 min(循环1次),然后将萃取液转移至已称重的500 mL平底烧瓶中,旋转蒸发至干,称重,计算脂肪含量。按照上述同样的方法再处理一份4～5 g样品,将萃取液和洗涤液(用体积比1…1的二氯甲烷-正己烷的混合溶液洗壁3次)一起转移至15 mL玻璃离心管中(约12 mL)。对于采用CALUX分析的样品,将上述溶液旋转蒸发至0.5 mL,再用正己烷定容至1.0 mL,于-20 ℃保存,待测;对于采用HRGC-HRMS分析的样品,将上述溶液旋转蒸发至1.5 mL,氮吹至近干,加入20 μL壬烷和5 μL回收率内标溶液,振荡均匀,待测。

1.3.2 样品的测定

将保存用于CALUX分析的样品恢复至室温,然后氮吹至近干,加入2 mL DMSO复溶;分取10 μL,与100 μLα-MEM培养基混合,配制成样品溶液。将细胞置于含10%(体积分数)胎牛血清和100 U·mL-1抗生素的α-MEM培养基中,于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。将细胞以(3～4)×104个/孔的密度接种到96孔白底洁净板中间的60个孔中,接种量为100 μL·孔-1。培养24 h后,向细胞中加入上述样品溶液,平行加入3份;暴露24 h后,用细胞裂解缓冲液振荡15 min结束细胞反应,在每个孔中加入50 μL荧光素酶试剂,再加入50 μL DMSO溶解并按照体积比1…1 000进行稀释,使用化学发光读板机测量溶液的相对光单位(RLU值)。

将用于HRGC-HRMS分析的样品按照1.2节仪器工作条件进行测定。

1.4 毒性当量的评估

基于HRGC-HRMS的毒性当量结果以TEQ值表示,参考文献[16]和2005年世界卫生组织确定的毒性当量因子(TEF)计算TEQ上、下限值。

基于CALUX的毒性当量结果以BEQ值表示,通过2,3,7,8-TCDD的响应曲线,利用拟合的四参数希尔方程计算得到样品中2,3,7,8-TCDD的含量,即样品的BEQ值。

2 结果与讨论

2.1 HRGC-HRMS的测定结果

2.1.1 标准曲线和检出限

按照1.2节仪器工作条件测定17种PCDD/Fs的混合标准溶液系列,以目标物的质量浓度为横坐标,目标物与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,17种目标物标准曲线的相关系数均大于0.990 0,相关性较好,满足测定的要求。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)。结果显示：2,3,7,8-TCDD和2,3,7,8-TCDF的检出限为0.04 ng·kg-1,OCDD和OCDF的检出限为0.40 ng·kg-1,其余13种目标物的检出限均为0.20 ng·kg-1。

2.1.2 样品中17种PCDD/Fs的含量

采用HRGC-HRMS对收集的24份样品进行测定,内标法定量,17种PCDD/Fs的中位值如图1所示。

图1 样品中17种PCDD/Fs的含量Fig.1 Contents of 17 PCDD/Fs in the samples

结果表明：17种PCDD/Fs在肉类样品中的总检出量为0.43～1.07 pg·g-1,在海鲜类样品中的总检出量为0.09～2.21 pg·g-1,在配方乳粉样品中的总检出量为0.09～0.42 pg·g-1。由于PCDD/Fs主要为脂溶性化合物,容易积累于富含脂肪的食品中,而配方乳粉的主要成分为蛋白质,因此其中PCDD/Fs的含量较低。7种PCDDs在24份样品中的平均检出率为29%,10种PCDFs的平均检出率为37%,二者差别不大;17种目标物中1,2,3,4,6,7,8-HpCDF的检出率最高,为63%,其次是2,3,4,6,7,8-HpCDF和OCDD,检出率各为50%;1,2,3,4,7,8,9-HpCDF仅在2份样品中有检出,检出率最低,为8%。

2.2 CALUX的测定结果

以DMSO稀释2,3,7,8-TCDD标准溶液,绘制质量浓度为48.94,1.472×102,4.411×102,1.327×103,3.961×103,1.191×104,3.574×104,1.000×105,3.000×105pg·L-1的2,3,7,8-TCDD标准溶液系列的RLU值(y)与质量浓度(x)对数的响应曲线,结果如图2所示。

图2 2,3,7,8-TCDD的响应曲线Fig.2 Response curve of 2,3,7,8-TCDD

使用origin软件进行拟合,得到四参数希尔方程为y=1.437×105+2.497×106/[1+10(lg3.8-lgx)×9.9],相关系数为0.999 7。绘制3条曲线,计算各点RLU值的变异系数(CV)。结果显示,当2,3,7,8-TCDD质量浓度为48.94～1.000×105pg·L-1时,每个点的CV值均低于20%。因此,将48.94～1.000×105pg·L-1作为该标准曲线定量的线性范围。若样品中2,3,7,8-TCDD的计算结果高于线性范围上限,需要对样品进行稀释后再检测。

2.3 基于CALUX和HRGC-HRMS评估17种PCDD/Fs的毒性当量

根据HRGC-HRMS和CALUX的测定结果,按照1.4节方法评估24份样品中17种PCDD/Fs的毒性当量,结果见表1;7种PCDDs和10种PCDFs的毒性当量(TEQ上限值)贡献率如图3所示。

表1 样品中17种PCDD/Fs的毒性当量结果

图3 样品中PCDDs和PCDFs的毒性当量贡献率Fig.3 Toxic equivalent contribution rates of PCDDs and PCDFs in the samples

结果表明：HRGC-HRMS得到的样品的TEQ下限值为0.001～0.106 pg·g-1,TEQ上限值为0.004～0.242 pg·g-1,远低于欧盟法规EC 1881/2006中规定的限量值(3.5 pg·g-1);CALUX得到的肉类样品的BEQ值为0.74～1.30 pg·g-1,海鲜类样品的BEQ值为0.31～0.63 pg·g-1,配方乳粉样品的BEQ值为0.043～0.074 pg·g-1。虽然目前有不少研究已经将CALUX应用于牛奶、肉类、蛋类、鱼和鱼油、海产品等食品和动物饲料中二英类物质的检测, 但是并没有形成以CALUX为标准的限量值。从本工作试验结果来看,3种动物源性固态食品的BEQ值均大于使用HRGC-HRMS测定得到的TEQ值,这也与其他研究结果类似[12,16]。CALUX测定的是样品提取物中能与芳基烃受体(AhR)结合的化合物,这些化合物不仅包括二英、呋喃以及多氯联苯等,也包括提取脂肪中的其他卤代化合物,因此BEQ值与TEQ值相比存在差异。从PCDDs和PCFDs的毒性当量(TEQ上限值)贡献率来看,几乎所有样品中均以PCDDs占据主导,其对PCDD/Fs总毒性当量的平均贡献率达到74.3%,而PCDFs的平均贡献率仅为25.7%。

2.4 基于CALUX和HRGC-HRMS评估17种PCDD/Fs毒性当量的相关性分析

为分析基于CALUX和HRGC-HRMS得到的毒性当量结果之间的关系,绘制了TEQ值与BEQ/TEQ比值的函数关系,结果如图4所示。

图4 TEQ值与BEQ/TEQ比值的函数关系Fig.4 Functional relationship between TEQ value and BEQ/TEQ value ratio

由图4可知：以TEQ下限值为计算依据时,对于较低的毒性当量(TEQ下限值小于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值波动相对较大,对于较高的毒性当量(TEQ下限值大于0.020 pg·g-1),BEQ/TEQ比值趋于稳定;以TEQ上限值为计算依据时,BEQ/TEQ比值的波动范围相对较小。

为进一步分析这两种方法测定结果之间的关系,使CALUX能在动物源性固态食品中二英类化合物筛查中得以应用,分别建立了肉类、海鲜类和配方乳粉中17种PCDD/Fs的BEQ值与TEQ值的关系曲线,结果如图5所示。

图5 样品中17种PCDD/Fs的BEQ值与TEQ值的关系曲线Fig.5 Relation curves between BEQ and TEQ values of 17 PCDD/Fs in the samples

由图5可知：3种类型的动物源性固态食品中17种PCDD/Fs的BEQ值与TEQ值之间存在一定的相关性,BEQ值与TEQ上限值的相关性均显著高于BEQ值与TEQ下限值的;配方乳粉样品的BEQ值与TEQ上限值的相关性最低(相关系数为0.475 1),海鲜类样品的BEQ值与TEQ上限值的相关性较高(相关系数为0.907 4)。因此,在海鲜类样品中,基于CALUX得到的BEQ值与基于HRGC-HRMS得到的TEQ上限值较接近,当BEQ值大于0.50 pg·g-1时,可使用方程BEQ=3.989×TEQ(上限值)+0.195 4来对CALUX的毒性当量结果进行换算,从而评价食品的风险性;肉类和配方乳粉样品的BEQ值与TEQ值相关性较差,不建议使用CALUX对这两类动物源性固态食品的毒性当量进行换算。

本工作基于CALUX和HRGC-HRMS评估了肉类、海鲜类与配方乳粉等3类动物源性固态食品中7种PCDDs和10种PCDFs的毒性当量,并分析了二者之间的相关性。在后续研究中可以补充dl-PCBs的拟合分析,进一步完善CALUX快速筛查二英类化合物毒性当量一致性的评估结果,并通过更大量的样品数据进行验证,以提高这种生物法测定结果的通用性与认可度。