高效液相色谱-示差折光检测器法测定复配消毒液中3种双链季铵盐的含量

睢超霞,袁 鹏,张文豪*,刘吉起,杨宁辉

(1.河南省医学高等专科学校,郑州 451191;2.河南省疾病预防控制中心,郑州 450003)

季铵盐是一种阳离子表面活性剂,可通过静电力、氢键和疏水作用改变细胞膜通透性,抑制或破坏细胞内生物氧化、呼吸代谢,从而使蛋白酶变性,在消毒领域应用广泛。迄今为止,国际上已开发了四代季铵盐消毒产品[1]：第一代是单链烷基二甲基苄基氯(溴)化铵,其中烷基链碳原子数为12～16时的杀菌效果最佳;第二代是在第一代产品的苯环或氨基上进行取代反应得到的衍生物;第三代是双烷基二甲基氯(溴)化铵,其中双烷基碳原子数为8～10时的杀菌效果最佳,其杀菌能力远高于单链季铵盐的;第四代是第三代双链季铵盐与单链季铵盐、聚六亚甲基双胍、乙醇、戊二醛等消毒成分的复配产品,其杀菌效果较传统的单配方季铵盐消毒产品增强2～8倍,逐渐成为市场上的主流产品。

复配消毒液具有合成工艺简单、气味小、对新型冠状病毒杀灭效果好等优点,广泛应用于新型冠状病毒的预防性消毒[2]。为保障消毒效果,需要建立合适的检测方法测定复配消毒液中双链季铵盐的含量。传统的容量分析法(银量法或四苯硼钠法)常应用于单配方消毒液中双链季铵盐含量的测定,而复配消毒液成分复杂,干扰多,采用该方法时得到的测定结果偏差较大[3]。液相色谱法采用分离后测定的模式,可用于复配消毒液成分的检测[4]。文献[5]和文献[6]采用高效液相色谱法,以通用型蒸发光散射检测器测定消毒液中双链季铵盐的含量,缺点是线性范围较窄,检测结果的准确度和重现性较差;此外,蒸发光散射检测器需要额外配备氮气发生装置,气体压力波动易造成基线漂移或出现鬼峰。高效液相色谱-串联质谱法[7]和离子色谱法[8]也应用于季铵盐含量的测定,但昂贵的仪器和复杂的操作限制了其在基层实验室的应用。示差折光检测器是基层实验室普遍配备的通用型检测器。因此,本工作提出了高效液相色谱-示差折光检测器法测定复配消毒液中二癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、辛基癸基二甲基氯化铵等3种双链季铵盐含量的方法,为复配消毒液中双链季铵盐化学成分的检测提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪,配1260 Infinity II示差折光检测器;CT15RE型高速离心机;BP211D型电子天平;PB-10型酸度计;PS3200型超声波振荡器;LL1C61型纯水机。

混合标准储备溶液：采用四硼酸钠滴定法[9]测定二癸基二甲基氯化铵、辛基癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵标准品的质量分数,分别为97.2%,98.7%,98.3%;取102.9 mg二癸基二甲基氯化铵、101.3 mg辛基癸基二甲基氯化铵、101.7 mg二辛基二甲基氯化铵等3种双链季铵盐标准品,用流动相溶解并定容至100 mL,配制成3种目标物质量浓度均为1 000 mg·L-1的混合标准储备溶液,于4 ℃冰箱保存。

混合标准溶液系列：分别取0.50,1.00,3.00,5.00,10.00 mL混合标准储备溶液,用流动相稀释并定容至10 mL,摇匀,配制成质量浓度为50,100,300,500,1 000 mg·L-1的混合标准溶液系列。

二癸基二甲基溴化铵、辛基癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、丁烷磺酸钠标准品的纯度均不小于98.0%;二癸基二甲基氯化铵标准品的纯度不小于95.0%;乙腈为色谱纯;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

Welchrom C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温30 ℃;流动相为体积比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸钠溶液的混合溶液(pH 3.5),等度洗脱;流量1.0 mL·min-1;进样量10.0 μL;示差折光检测器,折射率单位(RIU)模式,温度30 ℃。

1.3 试验方法

取5.0 mL复配消毒液样品,用流动相稀释至50 mL,超声10 min,静置至室温,用0.45 μm尼龙滤膜过滤,滤液按照仪器工作条件进行测定。以色谱保留时间定性,标准曲线外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测器

常见的单链季铵盐,如十二烷基二甲基苄基溴化铵含有苄基基团在260 nm附近出现苄基生色团的特征紫外吸收峰(图1中曲线1),因此采用液相色谱-紫外检测器法可以测定单链季铵盐的含量[10]。复配消毒液中常用的双链季铵盐有二癸基二甲基氯化铵、二癸基二甲基溴化铵、辛基癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵等。以二癸基二甲基溴化铵为例,该化合物是饱和单键碳氢化合物,只能产生σ→σ*跃迁,在紫外-可见光区没有吸收峰(图1中曲线2),也无荧光信号,因此无法采用液相色谱-紫外检测器法或荧光检测器法进行检测,需要选择通用型检测器。

1-十二烷基二甲基苄基溴化铵;2-二癸基二甲基溴化铵图1 单链和双链季铵盐的紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectra of single-chain and double-chain quaternary ammonium salts

复配消毒液中双链季铵盐的含量较高(质量浓度大于1.0 g·L-1),无需采用灵敏度高、价格昂贵的蒸发光散射检测器或质谱检测器。示差折光检测器是根据物质折射率的差异进行测定,优点是通用性强、操作简便,适用于常量分析,并且价格便宜、普及性高,适宜在基层实验室推广。因此,试验选择采用示差折光检测器测定双链季铵盐的含量。

2.1.2 流动相

采用高效液相色谱法检测时,极性季铵盐阳离子在非极性C18色谱柱上不易被保留,易出现与样品杂质共流出的现象;同时季铵盐阳离子与色谱柱固定相表面残存的带负电荷的硅羟基相互作用,吸附在固定相表面,造成色谱峰拖尾。在流动相中加入烷基磺酸钠离子对试剂,使磺酸根阴离子基团与季铵盐阳离子基团结合形成电中性的离子对,增加其在非极性固定相中的溶解度,增强极性离子的色谱保留,从而达到改善色谱分离效果的目的。因此,试验对比了丁烷磺酸钠对二癸基二甲基溴化铵色谱保留行为的影响,结果如图2所示。

图2 丁烷磺酸钠对二癸基二甲基溴化铵色谱保留行为的影响Fig.2 Effect of sodium butane sulfonate on chromatographic retention behavior of didecyl dimethyl ammonium bromide

由图2可知：加入丁烷磺酸钠离子对试剂后,二癸基二甲基溴化铵保留时间从6.35 min延长到11.23 min,色谱峰拖尾现象消失。

试验以混合标准溶液为待测对象,通过比较峰形、分离度及噪声等进一步优化流动相。与甲醇相比,以乙腈为有机相时,相同条件下噪声信号更低。离子对试剂是表面活性剂,流动相中离子对试剂的浓度一般为0.005～0.02 mol·L-1,浓度过高会对色谱柱固定相造成损伤;当丁烷磺酸钠浓度为0.01 mol·L-1时,目标物具有合适的保留时间,且峰形良好。一般C18色谱柱的酸度适用范围为pH 2.0～10.0,弱酸环境有利于目标物的分离,流动相pH低于2.0时会造成色谱柱的损坏;当流动相酸度为pH 3.5时,目标物分离度较好。流动相组成改变会影响物质的折射率,采用示差折光检测器时不适用于梯度洗脱;试验改变有机相与水相的比例, 观察3种目标物的保留时间和分离度; 当有机相与水相体积比为70…30时,3种目标物可在15 min内完全分离,并且分离度大于1.5。

综上分析,试验最终选择的流动相为体积比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸钠溶液的混合溶液(pH 3.5)。

2.1.3 色谱柱、柱温和检测器温度

试验分别考察了Welchrom C8(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Welchrom C18两种烷基色谱柱分离3种双链季铵盐的效果。结果表明,两种色谱柱均能分离3种双链季铵盐,但Welchrom C18色谱柱的柱效更高。因此,试验选用Welchrom C18色谱柱。

示差折光检测器的信号对温度变化较敏感,这可能会影响检测结果的重现性。实验室温度恒定为25 ℃,柱温比室温高时更易控制,但由于介质的折射率随温度升高而降低,柱温过高会导致灵敏度下降,因此试验设置柱温为30 ℃。同时,为避免检测器温度与柱温差异较大造成信号偏差,试验选择的检测器温度为30 ℃。

2.2 专属性试验

按照仪器工作条件对混合标准溶液和戊二醛复配二癸基二甲基氯化铵消毒液进行测定,典型色谱图见图3。

图3 典型色谱图Fig.3 Typical chromatograms

由图3可知,3种双链季铵盐分离效果较好,无拖尾现象,并且复配消毒液中的其他成分对目标物的检测不造成干扰,说明本方法专属性良好。

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

预试验发现复配消毒液样品无明显基质效应,标准曲线与工作曲线斜率比为0.98～1.02,因此采用过程简单的标准曲线法定量。按照仪器工作条件对混合标准溶液系列进行测定,以3种双链季铵盐的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示：3种双链季铵盐标准曲线的线性范围均为50～1 000 mg·L-1,线性回归方程和相关系数见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限

逐级稀释混合标准溶液系列,观察待测组分信噪比(S/N),分别以信噪比为3,10时对应的质量浓度为检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表1。

2.4 精密度和回收试验

取复配消毒液样品1.0 mL,对其进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验(用流动相稀释到10 mL),每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)

由表2可知,3种双链季铵盐的回收率为91.0%～105%,测定值的RSD为1.3%～2.2%,表明本方法具有较好的精密度和准确度。

2.5 方法对比

分别采用本方法和高效液相色谱-蒸发光散射检测器法[Welchrom C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温35 ℃;流动相A为0.1%(体积分数)三氟乙酸溶液,B为乙腈;流量1.0 mL·min-1;进样量10.0 μL。梯度洗脱程序：0～1.0 min,A为55%;1.0～25.0 min,A由55%降至0;25.0～25.1 min,A由0跳转至55%,保持2.0 min。雾化温度50 ℃;蒸发温度50 ℃;气体流量1.6 L·min-1]对同一复配消毒液样品中的二癸基二甲基氯化铵进行7次重复测定,采用独立样本t检验比较两种方法是否有显著性差异。结果显示,二癸基二甲基氯化铵测定值分别为1.06～1.18 g·L-1(本方法)和1.10～1.19 g·L-1(高效液相色谱-蒸发光散射检测器法),两组测定结果t值为1.85,P值为0.089,表明两种方法无显著性差异。

本工作提出了高效液相色谱-示差折光检测器法测定复配消毒液中3种双链季铵盐含量的方法,该方法专属性好、方便快速、稳定性和重复性高,适用于复配消毒液中常量双链季铵盐的测定。