亏缺灌溉对河套灌区向日葵土壤微生物群落结构多样性的影响

赵莎,李为萍,冯梁,池曌男,张家鹏,吴怡萱,王佳爽

(内蒙古农业大学水利与土木建筑工程学院,内蒙古 呼和浩特 010018)

河套灌区是中国重要的粮油生产基地,近年来灌区引黄水量减少及不合理的灌溉制度导致农业用水紧张、地下水位上升,土壤盐渍化加剧[1-2]、土壤微生物菌群结构失衡[3]等问题突出,严重破坏了灌区土壤微环境.因此大力发展节水农业,保障灌区农田水土环境和生态环境健康是灌区发展的首要任务[4-5].土壤微生物是土壤生态系统中极其重要且最为活跃的肥力因子之一,是土壤养分转化和有机物分解过程的重要参与者,可反映土壤的质量和健康状况[6-7].灌溉作为农业生产中可人为调控且对土壤环境影响最为深刻的农业措施之一[8],土壤水分条件的变化会影响土壤微生物活性及生态系统的功能[9],因此从微生物的角度制定适宜的灌水制度,对于改善土壤生态环境具有重要意义.

以往学者们多从节水控盐效果、作物生长产量及水分利用效率[10-11]等角度评价节水灌溉的效果及意义,而将节水灌溉与土壤微生物相结合,探讨亏缺灌溉下作物全生育期土壤微生物群落的动态变化规律及影响机理还缺乏系统的研究.目前研究微生物的方法多采用稀释平板涂布法培养微生物,但这种方法测定的微生物丰度不到总体的10%,而高通量测序具有低成本、高通量、高精确度的优点,能够获得更为全面的物种结构[12].

为此,文中基于高通量测序技术,分析亏缺灌溉下向日葵土壤微生物群落结构的季节性变化,探讨土壤微生物群落结构及多样性与理化性质的内在联系,为河套灌区发展节水农业、改善土壤微环境提供理论支撑,从而保护农田生态系统、促进农业可持续发展.

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年5—9月在位于河套灌区的巴彦淖尔市农牧业科学研究院的试验田(107°16′E,38°52′N)进行.试验区属温带大陆性季风气候,年均日照时数为3 223 h,年均蒸发量为1 937.9 mm,年均降水量为138.8 mm且多集中在7—8月份,平均无霜期约为130 d.

2020年试验区作物生育期内(5—9月份)总降雨量为202.4 mm.试验地0～20 cm土壤质地为粉砂壤土,平均容重为1.55 g/cm3,平均全盐量为6.58 g/kg,pH为8.5.土壤表层基础肥力为有机质质量比为10.19 g/kg,水解性氮质量比为53.27 mg/kg,速效磷质量比为10.29 mg/kg,速效钾质量比为155.2 mg/kg.

1.2 试验设计

供试作物为食用向日葵(HZ2399).试验设置3个灌水水平,以当地灌水量为对照CK(春灌水240 mm,现蕾期灌水90 mm),设置轻度水分亏缺W1(春灌水量120 mm,现蕾期灌水90 mm)和重度水分亏缺W2(春灌水量120 mm,现蕾期不灌水).各处理施氮量相同,底肥均施用磷酸二胺(含氮量18%),追肥施用尿素(含氮量46%).

2次灌水时间分别为5月10日和7月15日,采用黄河水畦灌,水表控制灌水量.表1为试验设计表,m为灌水定额、N为灌水次数、M为灌溉定额、FN为施氮量.

表1 试验设计表

试验小区面积为24 m×6 m,小区四周布设1 m深塑料薄膜,以防水盐及养分侧渗.试验采用完全随机区组设计,每个处理3次重复,共计9个小区.向日葵播种日期为 5 月 28日,宽窄行种植模式,宽行距1.0 m,窄行距0.4 m,株距0.55 m,种植密度约为25 000株/hm2.向日葵采用人工覆膜点播的方式种植,其他田间管理措施同当地种植习惯.

1.3 测定指标及方法

在向日葵苗期(播种后30 d)、现蕾期灌水1周后(播种后50 d)、开花期(播种后70 d)及成熟期(播种后105 d),采用五点取样法对0～20 cm深度土壤进行取样,每个小区重复3次.同小区样品混合均匀分为2份,一份装入无菌自封袋并置于-80 ℃下保存用于微生物测定,另一份土样室内自然风干,研磨后过2 mm筛,用于测定土壤理化性质.

土壤质量含水率采用烘干法测定;采用电导率仪(DDS-307A,上海雷磁)和pH 计(梅特勒-托利多仪器,上海)测定土水质量比为1∶5的土壤浸提液的电导率(EC)及酸碱度(pH);土壤硝态氮和铵态氮质量比采用 2 mol/L的KCl溶液浸提土样后(土∶溶液=1∶5),采用紫外分光光度计进行测定;土壤温度采用智能多点土壤温湿度记录仪(YM-01)进行定位监测,传感器埋设在20 cm土层深度处,每日0:00—24:00每间隔1 h采集一次温度,将24个土壤温度数据的平均值作为有效土壤日平均温度.

从采集的土样中称取0.4 g鲜土样,使用DNA抽提试剂盒 (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)对土壤总DNA进行提取,用NanoDrop2000紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度.使用引物序列338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 扩增细菌16S rRNA基因,使用引物序列 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)扩增真菌ITS1基因.PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,用Axygen凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物,使用QuantiFluor对回收产物进行定量,每个样品按照比例1∶1等量混合用于后续上机测序,土壤微生物的测定委托上海派森诺生物科技有限公司完成.

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 26.0进行方差分析和差异显著性检验,Orgin 2021绘图,Mothur软件计算Chao1指数和Shannon指数,R4.1.0软件的ggplot2,dplyr和ggcor等包进行Pearson相关性分析及冗余分析(RDA).

2 试验结果与分析

2.1 亏缺灌溉对土壤理化性质的影响

不同处理向日葵各生育期土壤理化性质如表2所示,SOM为质量含水率、EC为电导率、pH为酸碱度、Temp为温度,τm为质量比.与CK相比,处理W1和W2各生育期土壤质量含水率分别平均降低了1.09%和2.55%,土壤pH值分别平均降低了0.13和0.16,土壤温度分别平均提高了1.44和1.78 ℃,EC分别平均提高了0.75,2.11 mS/cm;W1各生育期土壤硝态氮质量比平均提高了14.2%.与W2相比,处理W1和CK显著提高了从苗期到开花期土壤的铵态氮质量比,显著降低了各生育期土壤EC(P<0.05).

表2 不同处理向日葵生育期土壤理化指标

随着向日葵生育期的推进,各处理pH 不断升高,温度、硝态氮及铵态氮质量比呈先升高后降低的趋势.处理W1与CK的质量含水率在现蕾期升高后不断降低,土壤EC在现蕾期降低后不断升高.

2.2 亏缺灌溉对土壤微生物多样性的影响

亏缺灌溉下向日葵各生育期土壤微生物的α多样性如图1所示.ASV数量、Chao1指数、Shannon指数等各项指标分别表示微生物的物种数量、群落丰富度及多样性.就细菌而言,苗期W1,W2与CK相比,Chao1指数显著增加了8.1%和6.2%.现蕾期W1与CK相比,ASV数量和Chao1指数分别增加了12.8%(P<0.05)和4.1%.开花期W1与CK相比,ASV数量显著增加了18.8%.成熟期W1与CK和W2相比,ASV数量显著增加了14.3%和21.6%(P<0.05).向日葵全生育期W1处理的Shannon 指数最高,但各处理间差异不具有统计学意义(P>0.05).

注:ns表示P>0.05不显著,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P< 0.001

就真菌而言,在向日葵的各生育阶段,W1与CK和W2相比,ASV数量显著增加了21.7%～82.1%和13.8%～28.9%,Shannon指数显著增加了44.8%～121.2%和23.4%～107.2%(P<0.05),Chao1指数增加了21.9%～92.8%和4.8%～29.9%.W2的细菌多样性低于CK,但其真菌多样性高于CK,这表明真菌较细菌对于水分亏缺的耐受性更强.随着向日葵生育期的推进,微生物的多样性及丰富度整体上呈先升高后降低的趋势,现蕾期或开花期时达到峰值.

2.3 亏缺灌溉对土壤微生物群落结构的影响

亏缺灌溉下向日葵各生育期门水平土壤微生物群落组成及相对丰度RA如图2所示.微生物统计分析时,将平均相对丰度大于5%的菌门视为优势菌门.

图2 各处理不同生育期细菌、真菌门水平物种组成

细菌门水平的优势菌门包括变形菌门(26.36%～35.54%)、放线菌门(20.27%～30.98%)、绿弯菌门(11.28%～16.42%)、酸杆菌门(5.78%～12.18%).向日葵各生育期中,W1与CK和W2相比,变形菌门分别提高了1.68%～2.72%和3.05%～7.06%,绿弯菌门分别提高了1.88%～4.68%和2.28%～3.65%,酸杆菌门分别提高了1.47%～6.40%和0.51%～2.85%.W2放线菌门的相对丰度与CK和W1相比,分别提高了0.04%～7.56%和5.63%～10.62%.

真菌门水平的优势菌门为子囊菌门(64.17%～98.62%)、被孢霉门(0.26%～9.78%).在向日葵各生育期中,处理CK中子囊菌门的相对丰度较处理W1提高了1.45%～25.39%,较W2提高了2.57%～22.34%,这表明水分亏缺会抑制子囊菌门的生长.其中被孢霉门是W1独有的优势菌门,在现蕾期和成熟期相对丰度最高,全生育期内平均相对丰度较CK和W2提高了4.30%和3.59%.

综上,轻度水分亏缺提高了土壤细菌中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门以及真菌中被孢霉门等优势菌群的相对丰度.

2.4 亏缺灌溉下土壤理化性质对微生物的影响

2.4.1 土壤理化性质与微生物多样性的相关性分析

为揭示影响土壤微生物多样性的主要因素,将微生物的α多样性指数与土壤理化因子进行Pearson相关性分析,如图3所示.

注:A:细菌Chao1指数;B:细菌Shannon指数;C:细菌ASV数量;D:真菌Chao1指数;E:真菌Shannon指数;F:真菌ASV数量;硝态氮质量比;铵态氮质量比

就细菌而言,Chao1丰富度与质量含水率、温度、硝态氮质量比极显著相关(P<0.01),Shannon多样性与pH极显著相关(P<0.01),ASV数量与质量含水率、温度、硝态氮质量比极显著相关(P<0.01)、与EC显著相关(P<0.05).

就真菌而言,Chao1丰富度与温度和硝态氮质量比极显著相关(P<0.01),Shannon多样性与温度、硝态氮质量比显著相关(P<0.05)、与铵态氮质量比极显著相关(P<0.01),ASV数量与温度显著相关(P<0.05).

综上,含水率、温度、pH,EC、硝态氮质量比是影响细菌群落多样性的关键环境因子,温度、铵态氮质量比和硝态氮质量比是影响真菌群落多样性的关键环境因子.

2.4.2 土壤理化性质对微生物群落结构的影响

为探究土壤理化性质与微生物群落结构的相关性,将门水平微生物菌群的相对丰度与土壤理化因子进行冗余分析(RDA),结果如图4所示.冗余分析解释了细菌和真菌群落47.54%和53.22%的总方差.图4a表明质量含水率、EC、铵态氮质量比是影响细菌群落结构分布最主要的理化因子.细菌优势菌门与土壤理化性质的相关性表明:变形菌门与EC和pH呈负相关, 与其他4项因子呈正相关;放线菌门与EC,pH和温度呈正相关,与含水率、硝态氮质量比、铵态氮质量比呈负相关;绿弯菌门与硝态氮质量比、铵态氮质量比呈正相关,与其他4项因子呈负相关;酸杆菌门与EC和pH呈正相关关系,与其他4项因子呈负相关.

注:A,B,C,D分别表示苗期、现蕾期、开花期、成熟期;① 变形菌门 ② 放线菌门 ③ 绿弯菌门 ④ 酸杆菌门 ⑤ 芽单胞菌门 ⑥ 厚壁菌门 ⑦ 拟杆菌门 ⑧ 己科河菌门 ⑨ 浮霉菌门 ⑩ 硝化螺旋菌门 壶菌门 子囊菌门 担子菌门 球囊菌门 被孢霉门

图4b表明质量含水率、温度、EC是影响真菌群落结构分布最主要的理化因子,真菌优势菌门土壤理化性质的相关性表明:子囊菌门与EC呈负相关,与其他5项因子呈正相关;被孢霉门与pH和EC呈正相关,与其他4项因子呈负相关.

3 讨 论

灌溉是影响农田土壤水分状况的重要因素.水分状况的改变,一方面会对微生物细胞的渗透性产生直接影响,另一方面会通过改善土壤理化性质而间接对微生物产生影响[13].大量研究表明土壤微生物多样性与土壤含水率[14]、pH[15]、盐分[7]、温度[16]及养分[13]密切相关.文中研究中的Pearson 相关性分析也证实了以上结论,含水率、温度、pH,EC、硝态氮是影响细菌群落多样性的关键环境因子,温度、铵态氮和硝态氮是影响真菌群落多样性的关键环境因子.文中研究可知轻度水分亏缺提高了土壤微生物多样性,这是因为适宜的灌水量不仅为微生物的生命活动提供必需的水分,还有效改善了土壤通气状况[17],有利于微生物的生长繁殖;重度水分亏缺较正常灌水提高了真菌α多样性,降低了细菌α多样性,这表明细菌群落结构对水分的响应较真菌更为敏感,这是由于土壤细菌运动和吸收土壤中营养物质的过程都需要以水分为介质[18].

文中研究中的轻度水分亏缺处理提高了土壤细菌中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门,真菌中被孢霉门的相对丰度.变形菌门是富营养型厌氧菌,具有固氮作用,环境适应及抗病能力强[19];绿弯菌门是自养型有益厌氧细菌[20];酸杆菌门适宜生活在酸性环境中,可以降解植物残体[7];被孢霉门能够促进养分转化循环,保持土壤肥力[21].上述优势菌门的高丰度表明轻度水分亏缺优化了土壤菌群结构,有利于土壤中有益菌群的生长.冗余分析表明含水率、EC、铵态氮是影响细菌群落结构的主要因素,含水率、温度、EC是影响真菌群落结构的主要因素,大量研究成果也表明土壤优势类群相对丰度会随温度[16]、水分[14]和盐分[7]发生显著变化.文中研究中的EC与放线菌门呈正相关关系,表明土壤中盐分升高会促进放线菌门的生长,究其原因可能是放线菌门具有较强的耐盐碱性[22],因此在盐分最高的重度水分亏缺处理中丰度最高.此外,同一处理不同生育期微生物群落结构也存在差异,分析原因可能是随着生育期的推进,土壤盐碱度升高,土壤中可被微生物利用的水分及养分不断减少,导致厌氧型及富营养型微生物不断减少,耐盐碱微生物丰度上升,因此土壤微生物的群落结构及丰度也相应发生变化.

4 结 论

1) 与当地灌水量(春灌水240 mm,现蕾期灌水90 mm)相比,轻度水分亏缺W1(春灌水120 mm,现蕾期灌水90 mm)各生育期土壤pH值平均降低了0.13,土壤温度和硝态氮质量比分别平均提高了1.44 ℃和14.2%,同时提高了土壤微生物多样性及土壤细菌中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、真菌中被孢霉门等优势菌门的相对丰度.向日葵生育期内各处理土壤微生物多样性均表现为先上升后降低的趋势,峰值出现在现蕾期或开花期.

2) 含水率、温度、pH,EC和硝态氮质量比是影响细菌多样性的关键环境因子,温度、铵态氮质量比和硝态氮质量比是影响真菌多样性的关键环境因子.含水率、EC和铵态氮质量比是影响细菌群落结构的主要因子,含水率、温度和EC是影响真菌群落结构的主要因子.

3) 综合分析,轻度水分亏缺W1改善了土壤理化因子,优化了微生物群落结构,提高了微生物多样性,是适宜微生物生长的水分条件.