脓毒症并发急性肾损伤患者血清miR-181c和miR-578水平表达及临床意义

宋 飞，李 丹，余 梦，李 敏，丁 继，李兰兰（三峡大学第三临床医学院/国药葛洲坝中心医院重症医学科，湖北宜昌 443000）

脓毒症（sepsis）是患者对感染反应失调引起的器官功能障碍，是一种危及生命的临床综合征[1]。肾脏是脓毒症期间最早受伤的器官之一，急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是脓毒症患者常见的并发症，导致患者出现肾内血流重组、肾脏低灌注、肾小管损伤、细胞凋亡、纤维化、炎症反应等，甚至可能会导致肾功能衰竭，与极高的死亡率相关[2-3]。研究表明，大多数脓毒症就医时，已经发生AKI[4]。因此，早期准确识别脓毒症并发AKI 的生物标志物，并积极采取有效干预措施，对患者的临床治疗具有重要意义。微小核糖核酸（microRNA，miR）可以靶向多个基因，通过调控细胞增殖、分化、凋亡、发育，调节多种蛋白质的表达，参与多种信号途径，几乎涉及身体所有系统[5]。miR-181位于19 号染色体上，在核基因组中编码，在细胞质中成熟，然后易位到心肌细胞的线粒体基质中，通过调节线粒体基因表达并改变线粒体功能，改善不同器官中细胞的凋亡，在调节烧伤脓毒症诱导的AKI 中发挥重要作用[6-7]。miR-578 是一种功能性miRNA，抑制癌细胞的生长、侵袭、血管生成，增强细胞放射敏感度，在骨肉瘤、乳腺癌、肺癌等癌症中发挥抑癌基因的作用，在脓毒症患者中表达下调[8-9]。尽管有研究表明miR-181c 和miR-578 在脓毒症患者的作用，然而在脓毒症并发AKI 患者血清中的表达及临床意义，尚不明晰。因此，本研究通过检测脓毒症并发AKI 患者血清miR-181c 和miR-578 表达水平，分析二者与脓毒症并发AKI 的关系，为脓毒症并发AKI 患者的早期诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2022年1～12月在国药葛洲坝中心医院住院治疗的80 例脓毒症并发AKI 患者（AKI 组），其中男性48 例，女性32 例，年龄54.21±6.68 岁，BMI 24.23±6.68 kg/m2和80 例单纯脓毒症患者（非AKI 组），其中男性53 例，女性27 例，年龄53.37±6.54 岁，BMI 23.96±3.14 kg/m2。两组性别、年龄、BMI 比较差异均无统计学意义（χ2=0.671，t=0.804，0.534，P=0.413，0.423，0.594）。纳入标准：①两组患者均符合脓毒症[10]相关诊断标准；②AKI 组患者符合急性肾损伤[11]相关诊断标准；③发病时间≤发病时；④研究对象本人详知此项研究内容，并自愿签署同意书。排除标准：①慢性肾脏疾病或肾功能不全患者；②妊娠期或哺乳期妇女；③其他因素导致的AKI；④恶性肿瘤患者；⑤免疫系统疾病患者；⑥病例资料不完整者。本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 RNA 提取试剂盒（德国Qiagen公司）；逆转录和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。qRT-PCR 仪器ABI 7500 Fast 系统；cobasb123 型全自动血气分析仪，全自动生化分析仪（罗氏公司），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集及样本采集：收集两组脓毒症患者的年龄、性别、体质指数（BMI）、高血压史、糖尿病史、肺部感染等基本资料。所有患者入院次日清晨，空腹采血约3～5 ml 于干燥试管，离心半径为12 cm，时间为10 min，分离血清后，放入-20℃冰箱中保存，待检。

1.3.2 血清miR-181c，miR-578 水平检测：采用RNA 提取试剂盒提取血清样品中总RNA，使用逆转录试剂盒，按其说明书逆转录合成cDNA，反应条件：25℃ 5 min，37℃ 45min，85℃ 5s。实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测血清中miR-181c 和miR-578 的相对表达量。根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书配置反应体系。PCR 反应：50℃2min，95℃10min，95℃15min， 60℃ 60min，溶解曲线：95℃ 10 min 1 个循环，95℃ 15s，60℃ 60s，40 个循环进行qRT-PCR。以U6 作为内参，根据2-ΔΔCt计算miR-181c，miR-578 基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 血清指标的检测以及APACHE Ⅱ评分：采用cobasb123 型全自动血气分析仪检测血乳酸、氧合指数；采用全自动生化分析仪检测血清尿素氮、血肌酐水平。

采用APACHE Ⅱ评分[12]对患者病情进行评估，APACHE Ⅱ评分值与患者病情严重程度呈正相关，分值越高则患者病情越严重。

1.4 统计学分析 数据以SPSS 25.0 软件进行统计学分析，经正态性检验，符合正态分布，以均数±标准差（±s）描述，采用独立样本t检验进行组间计量资料比较，计数资料以百分率（%）表示，采用卡方（χ2）检验；多因素Logistic 回归分析影响脓毒症患者并发AKI 的因素；ROC 曲线分析血清miR-181c，miR-578 水平预测脓毒症患者并发AKI 的价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疾病史、APACHE Ⅱ评分、血清指标的比较 见表2。AKI 组肺部感染所占比例、动脉血乳酸、血肌酐、尿素氮水平以及APACHE Ⅱ评分均高于非AKI 组，氧合指数低于非AKI 组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组疾病史、APACHE Ⅱ评分、血清指标的比较[±s，n（%）]

表2 两组疾病史、APACHE Ⅱ评分、血清指标的比较[±s，n（%）]

项目n非AKI 组（n=80）AKI 组（n=80）t/χ2 值P 值高血压史有4628（60.87）18（39.13）3.0510.081无11452（45.61）62（54.39）糖尿病史有4121（51.22）20（48.78）0.0330.856无11959（49.58）60（50.42）肺部感染是9137（40.66）54（59.34）7.3640.007否6943（62.32）26（37.68）氧合指数（mmHg）-258.17±34.59196.38±26.5412.6760.000动脉血乳酸（mmol/L）-0.84±0.252.69±1.1314.2980.000血肌酐（μmol/L）-89.96±24.65264.77±53.1426.6910.000尿素氮（mmol/L）-8.31±2.2425.58±8.3217.9250.000 APACHE Ⅱ评分（分）-14.57±3.6919.41±4.857.1040.000

2.2 两组血清miR-181c，miR-578 水平比较 AKI组患者血清miR-181c 水平（1.47±0.36）高于非AKI组（1.03±0.28），血清miR-578水平（0.76±0.19）显著低于非AKI 组（1.05±0.31），差异有统计学意义（t=8.629，7.134，均P=0.000）。

2.3 多因素Logistic 回归分析脓毒症患者并发AKI的影响因素 见表3。以脓毒症患者并发AKI（并发=1，未并发=0）为因变量，以肺部感染（有=1，无=0）、动脉血乳酸、APACHE Ⅱ评分、氧合指数、miR-181c，miR-578（连续变量）为自变量，进行多因素Logistic 回归分析，结果显示miR-181c[OR（95%CI）：2.984（1.628～5.468）]、肺部感染[OR（95%CI）：1.946（1.250～3.031）]、动脉血乳酸[OR（95%CI）：1.457（1.073～1.978）]、APACHE Ⅱ评分[OR（95%CI）：2.283（1.393～3.741）]是脓毒症患者并发AKI 的危险因素（均P＜0.05）；miR-578[OR（95%CI）：0.742（0.631～0.873）]、氧合指数[OR（95%CI）：0.342（0.130～0.904）]为保护因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic 回归分析脓毒症患者并发AKI 的影响因素

2.4 血清miR-181c，miR-578 水平对脓毒症患者并发AKI 的预测价值 见表4 和图1。血清miR-181c 预测脓毒症患者并发AKI 的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.854；血清miR-578 预测脓毒症患者并发AKI 的AUC 为0.803；二者联合预测脓毒症患者并发AKI 的AUC 为0.915。二者联合预测脓毒症患者并发AKI 优于miR-181c，miR-578各自单独预测（Z=3.118，3.460，P=0.002，0.001）。

图1 血清miR-181c，miR-578 水平预测脓毒症患者并发AKI 的ROC 曲线

表4 血清miR 181c，miR 578 水平对脓毒症患者并发AKI 的预测价值

3 讨论

急性肾损伤（AKI）是住院和重症脓毒症患者易发生的危及生命的并发症，使患者的死亡率增加6～8 倍，患慢性肾病的风险增加三倍，多达四分之一的患者需要肾脏替代治疗[13]。但是，通过及时干预和有效治疗，AKI 可以在早期得到逆转，从而降低脓毒症并发AKI 患者的死亡率[14]。因此，识别脓毒症患者并发AKI 对于患者的治愈至关重要。

miRNA具有高度的序列保守性和组织特异性，其表达谱随疾病类型发生特定的变化，其表达失调与多种疾病发生、发展和预后密切相关[15]。miR-181c 影响细胞的增殖、存活和迁移，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌等多种癌症中表达上调[16]。SUN 等[17]发现miR-181c 通过与3’UTR中的靶位点结合，直接抑制细胞周期B1 蛋白的翻译，引起成骨细胞的细胞增殖异常以及细胞周期停滞，同时参与炎症和免疫反应，导致骨质流失。ROMAN 等[18]发现miR-181c 在心脏中协调着独特的核-线粒体机制，肥胖诱导的miR-181c 过表达通过介导下游基因的表达，导致心脏损伤，在心肌细胞中抑制miR-181c 的表达，可以通过改善线粒体功能来保持肥胖期间的心脏功能。张宇峰等[19]发现miR-181c 在急性脑梗死患者血清中高表达，与患者神经缺损程度相关，且高表达患者预后差。本研究结果发现，AKI 组患者血清miR-181c 水平显著高于非AKI 组，提示miR-181c 可能通过介导患者下游基因的表达，影响细胞生物学行为、炎症因子水平，与脓毒症患者并发AKI 密切相关。

miR-578 是一种目前研究较少的miRNA，在多种癌症中抑制肿瘤的发展。王维学等[20]发现，miR-578 在类风湿关节炎患者滑膜组织中表达显著降低，其高表达可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细的增殖、迁移及转移，从而减轻纤维化，减缓类风湿关节炎的病情发展。YAN 等[21]发现，椎间盘退变患者miR-578 表达显著降低，上调miR-578 表达可通过抑制细胞生长、促炎细胞因子的表达和维持细胞外基质降解，改善患者症状。GAO 等[8]发现，miR-578 可以调节脂多糖诱导的HK2 细胞模型，其高表达可以抑制脓毒症并发AKI 患者的炎症反应、细胞凋亡、肾组织严重纤维化。本研究结果发现，AKI 组患者血清miR-578 水平显著低于非AKI 组，提示miR-578 高表达可能通过抑制炎症因子水平、细胞凋亡、肾组织纤维化，抑制病情的发生，miR-578 在脓毒症患者并发AKI 患者血清中显著低表达可能是病情恶化的重要原因，miR-578 可作为脓毒症患者并发AKI 的生物标志物。进一步ROC 曲线分析显示，miR-181c，miR-578 二者联合预测脓毒症患者并发AKI 的效能优于miR-181c，miR-578各自单独预测，提示miR-181c，miR-578 二者对预测脓毒症并发AKI 患者具有重要指导价值，丰富了miR-181c，miR-578 在脓毒症患者并发AKI 中的研究，为感染类疾病提供一定的依据。研究表明，肺部感染、氧合指数、动脉血乳酸、APACHE Ⅱ评分与脓毒症并发AKI 患者病情的发生、发展和预后密切相关[22-23]。本研究进一步多因素Logistic 回归分析结果显示，miR-181c，肺部感染、动脉血乳酸、APACHE Ⅱ评分是脓毒症患者并发AKI 的危险因素；miR-578，氧合指数是保护因素，提示及时关注上述因素，对患者治疗措施的调整具有重要意义，可有效改善脓毒症患者并发AKI 的病情进展。

综上所述，脓毒症并发AKI 患者血清miR-181c 表达显著上调、miR-578 表达显著下调，二者联合对预测脓毒症患者并发AKI 有较好参考价值。然而，miR-181c，miR-578 参与脓毒症患者并发AKI 发生发展的具体机制仍需进一步研究。