非小细胞肺癌患者血清miR-873和miR-138-5p表达水平及其与免疫微环境及预后的相关性分析

刘 捷，杨玲玲，程秋霞，高 瞻（.重庆医科大学附属巴南医院呼吸与危重症医学科，重庆 400054；.陆军军医大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，重庆 400037）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全世界癌症相关死亡的主要原因，我国是NSCLC 高负担国家，据2020年全球癌症统计我国有82 万例肺癌新诊断病例和71.5 万例肺癌相关死亡病例[1-2]。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）是肿瘤细胞赖以生存的周围微环境，利于肿瘤细胞生长、增殖和侵袭，并参与免疫抑制和促进治疗耐药性，在NSCLC 的发生、侵袭和转移过程中起到作用[3]。微小核糖核酸（micro RNA，miRNAs）参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭和免疫逃逸等生物学过程，可通过调节免疫细胞功能影响TIME，进而影响肿瘤进展[4]。miR-873 是肿瘤诊断和预后的分子标志物，已被证实可通过调控其靶基因表达参与癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程，与肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤密切相关[5]。miR-138-5p 在胰腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多种癌症中被发现充当肿瘤抑制基因，miR-138-5p 表达缺失与癌细胞增殖、侵袭和癌症不良预后有关[6]。miR-873 和miR-138-5p 在NSCLC 的报道十分少见，其在NSCLC 的表达特点以及临床意义尚不清楚，鉴于此本研究拟探讨血清miR-873 和miR-138-5p 表达与NSCLC 患者免疫微环境以及预后的关系，以期为临床NSCLC 治疗和预后分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2019年2月～2021年2月重庆医科大学附属巴南医院收治的108 例NSCLC患者（NSCLC 组），男性65 例，女性43 例；年龄≥60 岁60 例，＜60 岁48 例；肿瘤直径≥3cm 57例，＜3cm 51 例；病理类型：鳞癌82 例，腺癌26例；分化程度：低中度分化72 例，高度分化36 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期59 例，Ⅲ～Ⅳ期49 例。纳入标准：①经穿刺活检或手术获得组织标本，病理学证实为NSCLC；②入组前未接受任何形式的化疗、放疗或靶向药物治疗；③有完整的临床资料；④标本的采集和处理符合临床试验的伦理规范和操作规程。排除标准：①其它部位原发恶性肿瘤；②血液肿瘤、血液疾病和免疫系统疾病。另选择同期于我院门诊体检中心体检的65 例健康志愿者为对照组，男性39 例，女性26 例，年龄≥60 岁42 例，＜60 岁23 例，两组性别和年龄分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），本研究已经获得我院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 miRNeasy Serum/Plasma Kit 试剂（德国QIAGEN 公司）；Primer Script RT 试剂盒，SYBR Green PCR Kit（日本Takara 公司）；Veriti PCR 仪（美国赛默飞公司）；Vectra 全自动定量病理成像分析系统（美国PerkinElmer）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-873，miR-138-5p 表达：所有患者入组次日清晨（对照组体检当日）采集静脉血3ml 注入干燥试管，待血液凝固后离心（相对离心力3 024×g，时间5min）获得血清，-80℃保存。取血清样本，miRNeasy Serum/Plasma Kit 试剂提取总RNA，使用Primer Script RT 试剂盒将总RNA 反转录为cDNA。SYBR Green PCR Kit 和Veriti PCR 仪进行qRT-PCR。反应条件：95℃初始变性5 min，95℃ 20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35 个循环，72℃最终延伸5 min。反应体系：SYBR®Premix Ex Taq™ II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物10μmol/L 各1μl，加反应缓冲液至25μl。引物序列：miR-873 的正向引物为5’-GGGGCAGGAACTT GTG AG-3’，反向引物为5’-GTGTGGTGTGGTATG GTGTG-3’。miR-138-5p 的正向引物为：5’-CTAGA GCTCAACTGAAGTGGCTAAACTG-3’，反向引物为5’-GCTAGGCGTTGAAGTTCTGCCTAAATGC-3’。β-actin（内参），上游：5’-TGCGTGACATTAAG GAGAA-3’，下游：5’-AAGGAA GGCTGGAAGAG T-3’。2-ΔΔCt计算miR-873和miR-138-5p相对表达量。

1.3.2 多重免疫荧光染色法检测TIME 指标：取肺癌组织石蜡标本，经脱蜡、水化，10 mmol/L 枸椽酸钠缓冲液孵育10 min，微波20 min，0.3g/dl H2O2处理抑制内源性过氧化物酶活性，5g/dl 脱脂奶粉孵育阻断非特异性结合，PBS 洗涤。加入一抗、二抗孵育、漂洗。多重免疫组织化学试剂盒进行荧光标记，DAPI 染料复染、封片，全自动定量病理成像分析系统进行分析，1+，2+，3+表示阳性程度，1+弱阳性，2+中等程度阳性，3+强阳性，采用组织化学评分（H 值）分析TIME 中CD3，CD4，CD8，CD68 和CD163，叉头状转录因子3（forked head transcription factor 3，FOXP3）、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T-cell immunoglobulin mucin molecule 3，TIM3）、程序性细胞死亡受体1（programmed cell death receptor 1，PD-1）和程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的蛋白表达情况，H 值=[（3+）%×3+（2+）%×2+（1+）%×1]×100[7]。

1.3.3 随访：NSCLC 患者出院后定期电话随访和门诊复查，随访截止2022年6月。记录随访期间NSCLC 患者生存情况。总生存（overall survival，OS）时间定义为自术后至全因死亡或随访截止时间。

1.4 统计学分析 SPSS 25.00 进行数据录入和分析，经K-S 法检验miR-873,miR-138-5p 和TIME指标符合正态分布以(±s)表示，采用student-t检验。Pearson 分析血清miR-873,miR-138-5p 表达与TIME 指标的相关性。Kaplan-Meier 法绘制不同miR-873 和miR-138-5p 表达下NSCLC 患者生存曲线，Log-Rank 检验生存率的差异。COX 比例风险回归模型分析影响NSCLC 患者预后的危险因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NSCLC 组和对照组血清miR 873,miR 138 5p 表达比较 见表1。NSCLC 组血清miR-873 和miR-138-5p 表达低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 NSCLC 组和对照组血清miR-873,miR-138-5p表达比较（±s）

表1 NSCLC 组和对照组血清miR-873,miR-138-5p表达比较（±s）

指标NSCLC 组（n=108）对照组（n=65）t 值P 值miR-873（2-ΔΔCt）1.02±0.23 3.15±0.82-25.426 0.001 miR-138-5p（2-ΔΔCt） 1.21±0.26 3.54±0.92-24.769 0.001

2.2 NSCLC 血清miR-873,miR-138-5p 表达与患者临床病理特征的关系 见表2。TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低中度分化患者血清miR-873 和miR-138-5p表达低于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、高度分化患者（均P＜0.05），不同性别、年龄分布、病理类型、肿瘤直径之间血清miR-873 和miR-138-5p 表达比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 不同NSCLC 临床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表达比较(±s)

表2 不同NSCLC 临床病理特征患者血清miR-873,miR-138-5p 表达比较(±s)

类 别nmiR-873（2-ΔΔCt）tPmiR-138-5p（2-ΔΔCt）tP性别男650.99±0.25 1.19±0.30 0.9490.345女431.07±0.161.24±0.21 1.8600.066年龄（岁）≥60601.00±0.26 1.18±0.31 1.1320.260 1.3880.168＜60481.05±0.181.25±0.18肿瘤直径（cm）≥3570.98±0.25 1.9220.057 1.17±0.25 1.9550.053＜3511.06±0.171.25±0.16病理类型鳞癌821.01±0.23 1.20±0.21 0.8270.410腺癌261.05±0.201.24±0.23 0.7960.428分化程度高度分化361.15±0.09 1.32±0.10 9.6150.001 6.8890.001低中度分化720.96±0.101.16±0.12 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期591.10±0.11 10.2530.001 1.26±0.16 3.3610.001ⅢA 期490.92±0.061.15±0.18

2.3 miR-873，miR-138-5p 表达与TIME 指标的相关性 见表3。NSCLC 患者CD3，CD4，CD8，CD68，CD163，FOXP3，LAG3，TIM3，PD-1 和PD-L1 的H值分别为5.21，4.02，13.02，2.02，1.32，1.16，3.35，16.02，17.43 和15.32。血清miR-873和miR-138-5p 表达与PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈负相关（均P＜0.05），与CD3，CD68，CD163，FOXP3，LAG3 和TIM3 的H值无相关性（均P＞0.05）。

表3 miR-873，miR-138-5p 表达与TIME 指标的相关性

2.4 不同miR-873,miR-138-5p 表达NSCLC 患者生存比较 中位随访21（4～40）月，108 例患者中失访5 例，余103 例患者在随访期间死亡56例，绘制Kaplan-Meier 生存曲线，低表达miR-873（＜1.02，n=52）和低表达miR-138-5p（＜1.21，n=53）NSCLC 患者OS 生存率为34.62%（18/52），32.08%（17/53），低于高表达miR-873（≥1.02，n=51） 和高表达miR-138-5p（ ≥1.21，n=50）NSCLC 患者的56.86%（29/51），60.00%（30/50），差异有统计学意义（Log-Rankχ2=4.724，5.607，均P＜0.05），见图1。

图1 不同miR-873，miR-138-5p 表达NSCLC 患者生存曲线

2.5 影响NSCLC 生存的因素分析 见表4。以NSCLC 患者生存情况为因变量（0=存活，1=死亡），纳入年龄（赋值：0=＜60 岁，1=≥60 岁），性别（赋值：0=女，1=男），肿瘤直径（赋值：0=＜3cm，1=≥3cm），病理类型（赋值：0=鳞癌，1=腺癌），分化程度（赋值：0=高度分化，1=低中度分化），TNM 分期（赋值：0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期），miR-873（赋值：0=高表达，1=低表达），miR-138-5p（赋值：0=高表达，1=低表达）为自变量。单因素COX比例风险回归分析结果显示分化程度、TNM 分期、miR-873,miR-138-5p 与NSCLC 患者预后有关（P＜0.05）。多因素COX 比例风险回归模型（向后逐步法筛选变量），结果显示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是NSCLC 患者不良预后的危险因素（P＜0.05），miR-873 和miR-138-5p 是保护因素（P＜0.05）。

表4 影响NSCLC 生存的单因素和多因素COX 比例风险回归

3 讨论

研究显示肿瘤往往与其赖以生存的微环境相依相行，肿瘤免疫微环境（TIME）是一个极其复杂的系统，包括细胞和非细胞成分，如血管、成纤维细胞、免疫细胞、骨髓来源的炎症细胞、信号化学物质和细胞外基质（extracellular matrix，ECM），上述细胞和非细胞成分均可与肿瘤细胞相互作用，促使恶性细胞表型和行为，如增殖、侵袭、上皮间充质转化、血管生成和耐药等，并影响免疫治疗应答，与肿瘤进展和预后密切相关[8-9]。TIME 中含有大量的免疫细胞，部分具有抑癌作用，比如CD8+T 细胞和自然杀伤细胞，部分抑制免疫功能发挥促瘤作用，如调节性T 细胞和髓源性抑制细胞。miRNAs 是一种小型非编码RNA，能通过抑制信使RNA 翻译或促进信使RNA 降解在转录后水平调节基因表达，包括癌症、心血管和代谢疾病在内的无数生理过程和病理过程高度依赖于miRNAs 的调节，miRNAs 在TIME 肿瘤细胞与其周围免疫细胞相互作用过程中发挥关键作用，miRNA 可控制肿瘤细胞产生趋化因子或细胞因子，影响免疫细胞的迁移和扩张，直接调节TIME的成分，促进效应功能、抗原呈递、表型极化和不同程度的免疫抑制，还可通过外泌体运输到免疫细胞，影响免疫微环境[10]。

miR-873 位于染色体9p21.1 上，包括miR-873-5p 和miR-873-3p 两个主要成员，miR-873 具有多种靶基因以及独特的催化活性、转录调控、结合等分子功能，miR-873 可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-Catenin，核因子-κβ 和丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶等信号通路，参与癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞周期、细胞干性和化疗反应等过程，影响癌症发展[11]。研究显示miR-873 在胃癌中表达下调，通过靶向含THUMP结构域蛋白1 抑制胃癌细胞增殖、侵袭，并促使化疗敏感[12]。在结肠癌发病机制中，miR-873 通过靶向调节肿瘤抑制候选基因3，抑制癌细胞的增殖、集落形成和侵袭，抑制癌细胞转移[13]。miR-873-5p在乳头状甲状腺癌组织和细胞系中表达下调，通过靶向CXC 趋化因子配体16 抑制p65 和Rel-B 磷酸化，降低基质金属蛋白酶1，9 和13mRNA 和蛋白表达，抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，发挥抑瘤作用[14]。本研究发现NSCLC 患者血清miR-873 表达降低，且与高TNM 分期、中低分化程度、不良预后有关。研究显示miR-873 可能通过调节叉头框蛋白M1 抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，并增加癌细胞凋亡[15]。进一步分析miR-873 与TIME指标PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈负相关，表明miR-873 可能参与TIME 调控过程，抑制NSCLC 进展。分析原因：首先，miR-873 通过直接结合PD-L1 的3’-未翻译区抑制PD-L1 的表达以及PD-L1 下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路，减弱乳腺癌细胞的干性和化疗耐药性[16]；其次，单核细胞通过诱导肿瘤细胞毒性，抑制转移，吞噬肿瘤物质和负调控Treg细胞，能够抑制肿瘤的进展，静息树突状细胞（又称未成熟树突状细胞）能有效地捕获抗原，通过调节T 细胞的活化，参与维持自我耐受性，抑制肺癌进展[17]，miR-873 可能通过降低单核细胞和静息树突状细胞相对比例参与TIME调控过程，抑制NSCLC 进展[18]。因此miR-873 表达降低，其抑癌作用减弱，导致NSCLC 恶性进展和不良预后的发生。

miR-138-5p 在多癌症类型表达下调，被称为肿瘤抑制因子，现有报道显示miR-138-5p 通过外泌体从乳腺癌细胞传递到肿瘤相关巨噬细胞，下调赖氨酸特异性去甲基化酶6B 的表达，抑制巨噬细胞M1 极化，刺激M2 极化，抑制肿瘤进展[19]。miR-138-5p 通过抑制靶向叉头盒C1 表达，抑制前列腺癌细胞增殖、集落形成、细胞迁移和侵袭，发挥肿瘤抑制基因作用[20]。miR-138-5p 还可通过靶向抑制DEK 表达，抑制胃癌细胞增殖和肿瘤生长[21]。miR-138-5p 在胶质瘤中下调，miR-138-5p 过表达可通过靶向抑制其靶基因高迁移率盒蛋白13，下调脊椎蛋白2 的表达，抑制胶质瘤血管生成[22]。本研究发现NSCLC 患者血清miR-138-5p 表达下调，且与高TNM 分期、中低分化程度、NSCLC 患者低生存率有关。分析miR-138-5p 参与NSCLC 的机制为：miR-138-5p 可能通过靶向smad 核相互作用蛋白1抑制肺癌细胞增殖和迁移[23]，miR-138-5p 可直接结合到CDK8 的3’未翻译区抑制细胞周期G0/G1 期阻滞，减缓癌细胞生长，增加癌细胞凋亡[24]。本研究发现miR-138-5p 与TIME 指标PD-1，PD-L1，CD4，CD8 的H值呈负相关，miR-138-5p 可能还参与NSCLC 的免疫应答，与TIME 有关。miR-138-5p 作为一种靶向PD-L1 的强肿瘤抑制因子[25]，可直接下调树突细胞和T 细胞上PD-L1 和PD-1 的表达，激活免疫系统，降低肿瘤细胞中Ki67 和微小染色体维持蛋白2 的表达，抑制肿瘤生长[26]。可见miR-138-5p 在NSCLC 发病机制中发挥抑癌基因作用，miR-138-5p 低表达可能促使NSCLC 恶性进展，与不良预后有关。

综上，NSCLC 患者血清miR-873 和miR-138-5p 表达均较健康对照组下调，miR-873 和miR-138-5p 表达缺失与NSCLC 恶性病理特征以及低生存率有关。miR-873 和miR-138-5p 可能通过调控TIME参与NSCLC 发病过程。本研究创新性地为证实miR-873，miR-138-5p 与NSCLC 病理特征、TIME以及预后的关系，为NSCLC 临床治疗提供了新的靶点，为预后分析提供了新的标志物。不足之处在于尚不能直接证实miR-873，miR-138-5p 与TIME的关系，仍需开展体外细胞培养或构建动物模型来进一步探讨。