温阳化浊通络方抑制系统性硬化病EndoMT的机制研究

李 凯, 王 倩, 段培培, 卞 华,3

(1.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室 河南 南阳 473004;2.南阳理工学院张仲景国医国药学院 河南 南阳 473004;3.河南中医药大学骨伤学院 河南 郑州 450046)

0 引言

系统性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一种以血管损伤、免疫紊乱、皮肤和/或内脏进行性纤维化为特征的自身免疫性疾病[1]。在SSc各种损伤的靶器官中,皮肤和肺部受累最常见,尤其是肺血管损伤和肺纤维化是影响SSc进展和预后的主要原因。超过70%的SSc患者伴随肺部病变,主要包括间质性肺病(interstitial lung disease, ILD)和肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH),这两种肺部病变占SSc相关死亡的60%[2]。目前认为SSc相关肺部病变是以微血管损伤和肺泡炎症等早期病理改变为始动因素,其中微血管损伤诱导的炎症和自身免疫反应直接或间接刺激成纤维细胞的活化,导致纤维化发生[3]。研究证实肺微血管内皮细胞损伤的机制主要与EndoMT、缺氧、自噬过度及炎症等相关[4]。

目前,SSc的整体治疗原则仍以抗炎、免疫调节、改善血液循环及抑制纤维化为主,比如抗TGF-β抗体CAT-192、抗CD-20抗体利妥昔单抗、环磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺等[5]。但是,临床数据显示这些药物的副作用以及长期治疗效果均难以令人满意。目前尚无有效的治疗手段从保护肺血管内皮细胞并改善肺功能角度来防治SSc,因此,致力于相关SSc新药开发是解决目前SSc治疗困局的最佳途径。本课题组既往系列研究表明,温阳化浊通络方治疗SSc疗效显著,其作用机制主要为抗纤维化,调节免疫失衡和保护血管。研究发现,温阳化浊通络方能够降低SSc模型小鼠和SSc患者血清VEGF、CTGF、ET-1和vWF的表达水平[6-7],同时减少SSc患者血液中的内皮细胞数[8],表明温阳化浊通络方对SSc患者的血管具有保护作用,并改善SSc血管病变。但是,温阳化浊通络方改善SSc血管病变的作用机制尚不清楚。因此,本研究旨在探讨温阳化浊通络方通过抑制HIF-1α/Foxm1/Smad信号通路介导的EndoMT来改善肺血管内皮细胞损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物准备

温阳化浊通络方的药物组成为黄芪、党参、山药、淫羊藿、熟地、桂枝、积雪草、白芥子、槌果藤、丝瓜络,这些中药均从河南省张仲景大药房购买,汤剂制作方法参考我们之前的论文[9]。HIF-1α抑制剂KC7F2(浓度为10 mmol/L,HY-18777,MCE公司)。

1.2 主要试剂与仪器

Masson三色染色试剂盒(G1340,北京索莱宝科技有限公司),免疫组化试剂盒(D601037-0050,上海生工生物工程有限公司),HIF-1α抗体(AF1009,江苏亲科生物研究中心有限公司),Foxm1抗体(AF7860,江苏亲科生物研究中心有限公司),smad3抗体(AF6362,江苏亲科生物研究中心有限公司),VE-Cadherin(AF6265,江苏亲科生物研究中心有限公司),vimentin(AF7013,江苏亲科生物研究中心有限公司)。

1.3 博来霉素诱导的SSc小鼠模型的构建和实验分组

6～8周龄,体重20 g左右的雄性 C57/BL6N小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司)被用来构建博来霉素诱导的SSc小鼠模型。小鼠随机分为7组,每组6只。一组小鼠不接受任何处理,标记为对照组。一组小鼠皮下注射100 μL PBS溶液,标记为PBS组。另外5组利用博来霉素构建SSc小鼠模型,被标记为模型组,动物模型构建的实验方案参照我们之前的研究[10],针对动物模型的药物处理方案如下。在SSc小鼠模型构建基础上,药物处理方案为:对照组小鼠、PBS组小鼠和模型组小鼠每天接受生理盐水灌胃处理(1 mL/day),WYHZTL-L+模型组小鼠接受低剂量温阳化浊通络方灌胃处理(药物剂量为11.75 g/kg/day),WYHZTL-M+模型组小鼠接受中剂量温阳化浊通络方灌胃处理(药物剂量为23.5 g/kg/day),WYHZTL-H+模型组小鼠接受高剂量温阳化浊通络方灌胃处理(药物剂量为47 g/kg/day),KC7F2+模型组小鼠接受KC7L2腹膜下注射处理(KC7L2溶解于PBS溶液,剂量为10 mg/kg)。所有的药物治疗持续4周,然后用氯胺酮(150 mg/kg)和乙酰丙嗪(15 mg/kg)的混合物腹膜内注射来麻醉并处死小鼠。肺组织立即放入福尔马林溶液中固定。PBS组被用来作为博来霉素的阴性对照。本研究的所有动物实验操作步骤均被南阳理工学院伦理委员会批准。

1.4 Masson染色和免疫组化染色

将小鼠肺组织固定并用石蜡包埋制作成组织蜡块,用切片机将蜡块切成4～5 μm厚度的病理切片。对于masson染色步骤,按照试剂盒说明书操作,切片常规脱蜡脱水后用weigert铁苏木素染色液染色,酸性乙醇分化液分化,masson蓝化液返蓝,丽春红品红染色液染色,磷钼酸溶液洗涤,苯胺蓝染色液染色,95%乙醇脱水,无水乙醇脱水,二甲苯透明,最后中性树胶封片。Masson染色后肌纤维呈红色,胶原纤维呈绿色或蓝色,主要用于区分胶原纤维和肌纤维。对于免疫组化染色步骤,按照试剂盒说明书操作,切片60 ℃烤片,二甲苯脱蜡,分别用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡水化,枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复,酶灭活,BSA封闭,加不同一抗置于4 ℃湿盒中孵育过夜,洗涤后滴加HRP标记的二抗,用DAB法显色,并用苏木素复染,脱色返蓝后用中性树脂封片。利用imageJ软件中的IHC插件进行免疫组化结果的定量分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 温阳化浊通络方的治疗作用

利用博来霉素诱导构建SSc小鼠模型,通过masson染色检测小鼠肺组织的纤维化程度,由图1可知,相对于对照组和PBS组,模型组小鼠的肺组织以及肺血管的胶原纤维染色明显增强,表明模型组小鼠的肺组织发生了明显的纤维化,证明了博来霉素诱导构建SSc小鼠模型构建成功。另外,在模型小鼠中分别施加温阳化浊通络方和KC7F2(HIF-1α抑制剂)处理,观察不同剂量的温阳化浊通络方和KC7F2对肺纤维化的治疗效果,masson染色结果显示,相对于模型组,低、中、高剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-L+模型组、WYHZTL-M+模型组、WYHZTL-H+模型组)和KC7F2(KC7F2+模型组)治疗后,小鼠肺组织和肺血管组织的胶原纤维染色强度显著降低,表明温阳化浊通络方和KC7F2能够显著抑制博来霉素诱导构建SSc小鼠肺纤维化。另外,相对于WYHZTL-L+模型组和WYHZTL-M+模型组,KC7F2+模型组和WYHZTL-H+模型组的小鼠肺组织和肺血管组织的胶原纤维染色强度显著降低,表明温阳化浊通络方治疗SSc肺纤维化具有剂量依赖性。

图1 在博来霉素诱导的SSc小鼠模型中观察温阳化浊通络方对肺纤维化的治疗作用注:WYHZTL-L为低剂量的温阳化浊通络方,WYHZTL-M为中剂量的温阳化浊通络方,WYHZTL-H为高剂量的温阳化浊通络方,KC7F2为HIF-1α抑制剂。

2.2 温阳化浊通络方的调控作用

在博来霉素诱导的SSc小鼠模型中,通过免疫组化检测了小鼠肺组织中的HIF-1α/Foxm1/smad3信号通路,以及EndoMT标志物VE-cadherin和vimentin的蛋白表达水平。由图2可知,相对于对照组和PBS组,模型组小鼠肺血管内皮细胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表达水平显著增高,而VE-cadherin的蛋白表达水平显著降低。相对于模型组,经过温阳化浊通络方或KC7F2的治疗后,小鼠肺血管内皮细胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表达水平显著降低,而VE-cadherin的蛋白表达水平显著提高。另外,相对于低剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-L+模型组),中、高剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-M+模型组、WYHZTL-H+模型组)对HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的蛋白表达水平具有更加显著的调控作用。而中、高剂量的温阳化浊通络方对于HIF-1α、Foxm1、smad3和VE-cadherin的调控作用无显著性差异。但是,相对于中剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-L+模型组),高剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-H+模型组)对于vimentin的抑制作用更加明显。另外,结果显示KC7F2(KC7F2+模型组)对于HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的调控作用与高剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-H+模型组)无显著性差异,但是优于低、中剂量的温阳化浊通络方(WYHZTL-L+模型组、WYHZTL-M+模型组)。这些结果表明,温阳化浊通络方和KC7F2能够通过抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路介导的EndoMT,改善SSc肺微血管内皮细胞损伤,而且温阳化浊通络方的这种效应存在剂量依赖性。

图2 在博来霉素诱导的SSc小鼠模型中观察温阳化浊通络方对HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路和EndoMT标志物的调控作用注:A:各组小鼠肺组织的免疫组化结果;B-F:不同蛋白的免疫组化结果的定量分析。WYHZTL-L为低剂量的温阳化浊通络方,WYHZTL-M为中剂量的温阳化浊通络方,WYHZTL-H为高剂量的温阳化浊通络方,KC7F2为HIF-1α抑制剂。ns表示没有统计学意义;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。

3 讨论

EndoMT指内皮细胞在受到刺激后获得间充质细胞样表型。在EndoMT过程中,由于驻留的内皮细胞从血管壁的组织细胞层分离并侵入周围组织,将导致血管内膜结构的破坏,造成血管损伤[11-12]。SSc的早期特征是内皮细胞的损伤,以及内膜的增生和血管腔的最终闭塞。毛细血管血流量减少加上血管生成不足会导致慢性缺氧和组织缺血,从而形成正反馈回路,维持血管重塑,而细胞外基质积聚导致纤维化进一步加剧了这种情况[13]。因此,抑制EndoMT进而改善血管内皮细胞损伤,可能是治疗SSc的有效途径之一。在本研究中,首先我们在博来霉素诱导的SSc小鼠模型中发现EndoMT标志物VE-cadherin和vimentin表达水平的失调,证实了SSc肺血管内皮细胞确实存在EndoMT的现象。

研究发现,SSc患者的血氧分压较健康对照显著降低,提示SSc发病过程中一直伴随长期慢性缺氧的症状。缺氧是促进内皮细胞EndoMT的有效刺激,HIF-1α能够诱导动脉血管内皮细胞EndoMT,进而导致纤维化的发生[14]。同时,Lavigne等[15]发现HIF-1α通过促进肺血管内皮细胞EndoMT导致放射线诱发的肺纤维化的发生。这些结果表明,缺氧诱导的肺血管内皮细胞EndoMT可能与HIF-1α有关。在本研究中,我们的结果证实了博来霉素诱导的SSc小鼠模型中HIF-1α表达水平上调,并且HIF-1α抑制剂KC7F2能够抑制SSc肺血管内皮细胞EndoMT,表明SSc发生发展过程中HIF-1α能够促进EndoMT的发生。

在SSc发生发展过程中,缺氧促进血管内皮细胞EndoMT的分子机制尚不清楚。研究发现用TGF-β和内皮素-1(endothelin-1, ET-1)处理的正常成纤维细胞也能够促进相同内皮细胞的EndoMT[16]。进一步研究发现,在血管内皮细胞中,TGF-β的激活能够促进Foxm1介导的内皮细胞EndoMT,其分子机制为Foxm1与Smad蛋白相互作用,上调促EndoMT因子(如Snail、Slug、Twist和Zeb等)的表达[17-18]。Huang等[18]发现Foxm1基因启动子区含有低氧反应元件(HRE),HIF-1α能够特异性地与Foxm1基因启动子HRE结合,促进Foxm1的表达水平。因此,HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路可能是促进内皮细胞EndoMT的分子机制之一。在SSc小鼠模型中,我们发现缺氧确实能够激活HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路和内皮细胞EndoMT,而抑制HIF-1α能够逆转这些效应。我们的研究证实了低氧环境下,HIF-1α/Foxm1/Sma3d信号通路的过度激活能够促进肺血管内皮细胞EndoMT,这是导致SSc肺血管损伤的重要机制之一。更重要的是,在SSc小鼠模型中,我们证实了温阳化浊通络方具有类似于HIF-1α抑制剂的效应,能够抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路介导的肺血管内皮细胞EndoMT。

综上,在本研究中,我们首先证实了SSc发生发展过程中肺血管内皮细胞EndoMT的存在。进一步地,我们阐释了低氧环境下,HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路的过度激活能够促进肺血管内皮细胞EndoMT,这是导致SSc肺血管损伤的重要机制之一。最后,我们发现温阳化浊通络方能够抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路介导的肺血管内皮细胞EndoMT,这可能是温阳化浊通络方保护肺血管治疗SSc的作用机制之一。