基于右旋糖酐酶制备小麦多孔淀粉及其特性

王博岩，李 强，吴一卓，章均哲，吴旭东，张 磊，吕明生，王淑军,

（1.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室 江苏海洋大学，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋生物技术重点实验室 江苏海洋大学，江苏连云港 222005；3.海阳市市场监督管理局，山东烟台 265100）

淀粉是自然界第二大碳水化合物，也是我国重要的食品和加工原料。通过物理、化学和酶法可制备功能淀粉，如：抗性淀粉、多孔淀粉、缓慢消化淀粉、淀粉基吸水剂、淀粉基表面活性剂、淀粉基絮凝剂等。功能淀粉主要应用于食品加工、食品包装材料、药物缓释等领域，提高了淀粉的应用价值[1-2]。其中多孔淀粉主要通过物理、化学和生物酶法等方法制备[3-4]。

生物酶法制备多孔淀粉工艺简单，绿色环保。葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶等单酶或多酶复合常用于制备多孔淀粉[5]。张倩倩等[6]对大米淀粉湿热处理后，选用α-淀粉酶来制备大米多孔淀粉。宋志伟等[7]使用α-淀粉酶水解玉米淀粉，显著提高了淀粉颗粒的比表面积。Das 等[8]用β-淀粉酶制备马铃薯和玉米多孔淀粉。Majzoobi 等[9]用α-淀粉酶来制备小麦多孔淀粉，吸水吸油率为27.87%和13.5%，甲基紫负载率为39.23%。然而，在小麦、红薯、玉米等淀粉中含有的α-1,6 糖苷键，其对淀粉酶的水解有一定的阻碍作用[10]。右旋糖酐酶（Dextranase）能够特异性水解α-1,6 糖苷键[11]。目前尚未见其用于制备多孔淀粉的报道。酶法制备的多孔淀粉广泛应用于环境、医药和食品等领域，用于香料、抗氧化剂的载体，负载植物精油、功能性药物和益生菌等活性物质[12-15]。功能性药物多具有敏感性高、水溶性低和稳定性差的特点[16-17]。通过多孔淀粉负载后，可以显著提高功能性药物的活性[18]。

本研究选用小麦淀粉和右旋糖酐酶制备多孔淀粉。测定了小麦多孔淀粉的比容积、溶解率、膨胀率以及吸水吸油率。选取两种广泛添加于功能性食品的药物（姜黄素和甲磺酸达比加群酯）和两种抗生素（制霉菌素和氧氟沙星），研究了小麦多孔淀粉的负载率，测定了负载姜黄素的多孔淀粉在模拟胃肠道的释放效果。研究结果以期为小麦多孔淀粉的加工提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食品级小麦淀粉 上海宝鼎酿造有限公司；右旋糖酐酶制备于糖单胞菌K1（发酵纯化制备，活性≥0.5 U/mL）、姜黄素、制霉菌素、氧氟沙星、甲磺酸达比加群酯 阿拉丁股份有限公司；DNS 显色剂（3,5-二硝基水杨酸）、氢氧化钠、磷酸二氢钾和甲醇 分析纯，国药集团；花生油 益海嘉里股份有限公司；胃蛋白酶（1:30000）都莱生物生物技术有限公司；胰蛋白酶（1:250）鼎国昌盛生物技术有限公司。

FreeZone 冻干机 LABCONCO 股份有限公司；Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪、is5 傅里叶红变换红外光谱仪 Thermo 股份有限公司；X’PERT POWDER XRD 射线衍射 PANalytical 股份有限公司；JSM-6390LA 扫描电镜 日本电子；SZ-100 粒度分析仪 HORIBA 股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 右旋糖酐酶制备小麦多孔淀粉 根据报道，物理处理有助于提高淀粉的酶解效率，本实验选用了湿热处理以提高多孔淀粉的制备效率[3]。

淀粉对酶敏感性的测定：称取3 g 烘干至恒重的小麦淀粉，加入5%～35%超纯水充分搅拌，密封后置于25 ℃水浴锅中平衡20 h 后，在110 ℃下恒温干燥箱中处理2 h，冷冻干燥后碾磨过200 目筛。称取0.4 g湿热处理小麦淀粉，加入1.6 mL（pH8.5，50 mmol/L）Tris-HCl 缓冲液，50 ℃水浴平衡10 min，加入1 mL酶液，50 ℃恒温振荡1 h，立即加入4% NaOH 2.5 mL溶液终止反应，用DNS 法测量释放的葡萄糖的量。根据公式（1）计算淀粉对酶的敏感性。

式中：c 为DNS 比色法测得的葡萄糖质量浓度，mg/mL；v 为反应体系中液相体积，mL；0.9 为从葡萄糖到淀粉的转化系数；m 为反应前淀粉质量，mg。

分别称取3 g 酶敏感性最佳的湿热处理淀粉与小麦淀粉，加入15 mL（pH8.5，50 mmol/L）Tris-HCl缓冲液，于烧杯中混合均匀，50 ℃恒温摇床中预热15 min，加入10 mL 酶液摇匀，在50 ℃下分别恒温振荡反应（2～16 h），在反应2、4、8、16 h 后加入4%NaOH 3 mL 溶液终止反应，12000 r/min 离心2 min，将淀粉冷冻干燥，研磨后过200 目备用。

1.2.2 小麦多孔淀粉的表面结构和粒径分析 将小麦淀粉、湿热小麦淀粉、酶解小麦淀粉、湿热并酶解不同时间的小麦淀粉均匀加在导电胶上，喷金后用扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM）在6000 倍下观测。多孔淀粉的粒径分布用粒度分析仪测定，将小麦淀粉与小麦多孔淀粉（湿热处理并酶解16 h 的小麦淀粉）加入去离子水，12 W 超声20 s使淀粉颗粒均匀分散后检测。

1.2.3 淀粉比容积、溶解率和膨胀率测定 采用张倩倩等[6]的方法确定多孔淀粉的比容积、溶解率和膨胀率。分别称取2 g 湿热并酶处理不同时间的小麦淀粉和天然小麦淀粉放入10 mL 量筒中。晃动量筒保持淀粉面水平，让淀粉自由落下，求每克淀粉所占的体积，则为淀粉比容积。分别称取0.3 g 湿热并酶处理不同时间的小麦淀粉和天然小麦淀粉，加入15 mL 蒸馏水于烧杯中混合均匀，在60 ℃下搅拌30 min，5000 r/min 离心10 min，将上清液置于水浴锅中沸水蒸干，然后于105 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重。根据公式计算溶解率（S）和膨胀率（B）：

式中：A 为上清液烘干后质量，g；W 为淀粉样品干质量，g；P 为离心后沉淀质量，g。

1.2.4 多孔淀粉吸水和吸油率的测定 采用Liu等[19]的方法测定多孔淀粉的吸水和吸油率。分别称取200 mg 湿热并酶处理不同时间的小麦淀粉和天然小麦淀粉置于小烧杯中，加入2 mL 的花生油/水混合并搅拌30 min，倒入已知质量的离心管中，以4000 r/min 离心10 min，倒出离心后的上层液，倒置至油水不再渗出，根据公式（4）计算吸油/水率。

式中：W0为离心管的质量，g；W1为多孔淀粉干质量，g；W2为离心后离心管吸水（油）后的淀粉质量，g。

1.2.5 多孔淀粉药品负载率的测定 采用Trindade等[20]的方法，测定姜黄素、甲磺酸达比加群酯、氧氟沙星和制霉菌素的负载率。即准确称量多孔淀粉（湿热并酶解16 h 的小麦淀粉），加入5 mL 去离子水制备均匀的乳液，加入1 mL 药品溶液（2 mg/mL），使多孔淀粉与药物的比例分别为10:1、20:1、40:1、80:1和160:1（w/w），超声搅拌30 min。5000 r/min 离心10 min，将上清液去除，沉淀冷冻干燥。将干燥的样品研磨后装入棕色玻璃瓶，-20 ℃储存。精确称量100 mg 固定化后的多孔淀粉，与1 mL 二甲基亚砜分析纯混合。使用涡旋振荡仪混匀振荡10 min 并在900 W 下超声处理10 min，用0.45 μm 滤膜过滤，重复两次。检测吸溶液的吸光度值（药品的吸收峰分别为姜黄素OD420nm，氧氟沙星OD324nm，甲磺酸达比加群酯OD340nm，制霉菌素OD310nm），依据标准曲线计算药品的负载量。根据公式（5）计算负载率。

标准曲线：将2 mg/mL 的药品用二甲基亚砜进行梯度稀释，以二甲基亚砜为空白，测定不同稀释液的吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.6 X 射线衍射测定 将干燥多孔淀粉、负载药品的多孔淀粉（160:1）和四种药品在CuKα（λ=0.15406 nm）、功率为1600 W（40 kV×40 mA）、扫描范围为5°～30°（2θ）、扫描速度5°/min、步长0.02 的条件下检测。

1.2.7 傅里叶红外光谱测定（FTIR）将干燥多孔淀粉、负载药品的多孔淀粉（160:1）和四种药品以1:200 比例与溴化钾的混合研磨呈粉状，在10 Pa 下压片成型，波数范围为4000～400 cm-1，分辨率为1 cm-1。

1.2.8 模拟多孔淀粉的胃肠道的溶出 姜黄素对光、热、pH 具有高度的敏感性[21]，选取负载姜黄素的多孔淀粉进行体外模拟释放试验。采用Marefati等[22]的方法制备模拟的胃液和肠液。首先加入2 g NaCl，7 mL 1 mol/L 的HCl 和0.26 g 胃蛋白酶，接着用1 mol/L HCl 调节至pH2 并用超纯水稀释至1 L 制备模拟胃液。500 mL 超纯水中加入6.8 g KH2PO4制备模拟肠液，然后加入胰酶（10 g/L），用0.1 mol/L NaOH 将pH 调节至6.5 并稀释至1 L。按照1.2.5 的方法，将100 mg 不同比例负载的药品加入1 mL 模拟胃液（pH=2.0），检测药品在模拟胃液中的释放。将负载药品的多孔淀粉装入透析袋（截留分子量3 kDa），放入含有胃液的EP 管中。在37 ℃放置0 至2.5 h，每30 min 取样检测。随即再将相同的透析袋置于1 mL 模拟肠液（pH6.5）中，在37 ℃放置0～5 h，每1 h 取样检测，根据公式（6）计算姜黄素的释放率。

1.3 数据处理

本研究试验均设置3 组平行，采用SPSS 24.0软件进行Tukey’s 检验且，P<0.05 为统计学上显著。采用Origin pro 9.1 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 淀粉含水量对酶敏感性的影响

湿热处理淀粉的含水量对右旋糖酐酶敏感性有显著影响。随着含水量的增加，淀粉对酶的敏感性也随之增加（图1）。当淀粉含水量为30%时，淀粉对酶敏感性最高，酶敏感性达到8.5%，显著高于含水量为25%和35%的7%和7.2%。增加含水量可使淀粉颗粒体积逐渐膨胀，支链淀粉附近的α-1,6 糖苷键发生断裂的可能性增加，影响淀粉的结构，淀粉的无定形区对酶的可及性会增加[23]。然而，淀粉含水量过高时，湿热处理使糊化程度加重，反而影响淀粉对酶的敏感性。因此，选择含水量为30%的淀粉进行湿热处理。

图1 小麦淀粉含水量对酶敏感性的影响Fig.1 Effect of wheat starch moisture content on enzyme sensitivity

2.2 小麦多孔淀粉的表面结构与粒径

如图2 所示，原淀粉表面光滑，经酶处理后，淀粉颗粒表面出现凹坑，这与已报道的文献相似[20]，随着酶解时间延长，淀粉表面出现的凹坑逐渐增多，淀粉颗粒也逐渐变小，湿热处理+酶解16 h 后，淀粉颗粒表面出现了明显的孔洞，表明右旋糖酐酶可以制备小麦多孔淀粉。而使用酶处理的原淀粉在16 h 仅有较少的凹坑，结果表明湿热处理有助于酶解制备多孔淀粉。经检测，小麦淀粉和小麦多孔淀粉的平均粒径分别为15.13±1.17、5.21±0.93 μm（图3）。结果表明，右旋糖酐酶对小麦淀粉表面侵蚀使得淀粉粒直径减小[24]。这与扫描电镜显示的结果一致。

图2 不同处理方式的小麦淀粉的扫描电镜图Fig.2 SEM of wheat starch treated in different ways

图3 酶解对小麦多孔淀粉粒径的影响Fig.3 Effect of enzymatic digestion on particle size of wheat porous starch

2.3 小麦多孔淀粉的比容积、溶解率和膨胀率

由表1 可知，随着酶解时间的延长多孔淀粉的比容积、溶解率和膨胀率均显著增加（P<0.05），酶解16 h 的小麦多孔淀粉比容积从1.21±0.01 提高到2.11±0.02 cm3/g。多孔淀粉的溶解率与膨胀率也分别达到了9.02%±0.21%与9.91%±0.22%。酶水解后，在非结晶区的直链淀粉会散出，从而提高了淀粉的溶解率[25]。在淀粉颗粒中形成的孔洞降低了其结构强度，水分子进入淀粉孔洞中，提高了淀粉的膨胀率。

表1 小麦多孔淀粉比容积、溶解率和膨胀率Table 1 Wheat porous starch specific volume,solubility and expansion ratio

2.4 小麦多孔淀粉的吸水和吸油率

表2 显示，随着酶解的时间的延长，小麦多孔淀粉的吸水和吸油能力显著提高（P<0.05）。酶解16 h的淀粉的吸水率和吸油率分别达到了80.12%±2.30%和78.23%±3.00%。淀粉颗粒的孔洞数量的增多，使水和油的分子更容易进入淀粉的内部，提高了淀粉的吸水率和吸油率[26]。

表2 小麦多孔淀粉吸水吸油率Table 2 Water and oil absorption rate of wheat porous starch

2.5 小麦多孔淀粉的负载率

表3 显示药物的负载率。随着多孔淀粉与药物比例的增加，多孔淀粉负载药物的量也随着增加。四种药品的平均负载率从14.30%±2.13%增加至75.07%±1.23%。多孔淀粉对不同药物的负载率没有显著性差异（P>0.05）。多孔淀粉增加了表面积，使药物负载于多孔淀粉中[27]。

2.6 小麦多孔淀粉负载药物的XRD 检测

对小麦淀粉、酶解小麦淀粉和负载药物的多孔淀粉的检测结果见图4。酶解后的小麦淀粉在15°、17°、18°、23.5°主峰略有下降，与Song 等[28]报道的α-淀粉酶水解使蜡质玉米淀粉和普通玉米淀粉的主峰略有下降相似。表明右旋糖酐酶制备小麦多孔淀粉没有破坏淀粉的晶体结构。文献报道多孔淀粉是典型A 型晶型，在2θ为15°、17°、18°、23.5°处形成特征峰[29]。通过对比淀粉、多孔淀粉、姜黄素、甲磺酸达比加群酯、制霉菌素、氧氟沙星的XRD 光谱图，负载了四种药物的小麦多孔淀粉未显示出其药物原有的特征峰。与报道的酪蛋白负载姜黄素的结果相似，即XRD 图谱中观察不到姜黄素的特征峰[28]。因此，小麦多孔淀粉负载四种药物后，四种药物的特征峰消失，表明四种药物已被成功地包埋在多孔淀粉中了[30]。

图4 小麦淀粉和酶解淀粉（A）、药品（B）和多孔淀粉包封药品（C）的XRDFig.4 XRD of wheat starch and enzymatic hydrolysis of starch(A),drugs (B) and porous starch encapsulated with drugs (C)

2.7 小麦多孔淀粉负载药物的FTIR 检测

图5A 显示，经酶处理后，小麦多孔淀粉特征吸收峰与小麦淀粉相比没有明显变化，多孔淀粉在2927、1646、1241、1367 cm-1处的特征峰分别为-CH2、C-C、C-O 和C-O-O 这与文献[31]报道的一致。表明酶处理后，多孔淀粉保留了基本成分。

图5 小麦淀粉和酶解淀粉（A）、多孔淀粉负载制霉菌素和氧氟沙星（B）和多孔淀粉负载姜黄素和甲磺酸达比加群酯（C）的红外图谱Fig.5 Infrared spectra of wheat starch and enzymatic hydrolysis of starch (A),porous starch encapsulated with mycophenolate and ofloxacin (B) and porous starch encapsulated with curcumin and dabigatranate mesylate (C)

FT-IR 光谱检测结果表明，小麦多孔淀粉均有效地负载了药物。多孔淀粉在1646 cm-1处有特征峰，负载制霉菌素后，该峰红移到1630 cm-1，负载氧氟沙星后，该峰红移到1622 cm-1，负载姜黄素后，该峰红移到1628 cm-1，负载甲磺酸达比加群酯后，该峰红移到1610 cm-1。此外，由图5B 和5C 可见，负载药物多孔淀粉均保留了药物和多孔淀粉的特征峰。如：姜黄素在1602 cm-1处可以观察到的特征峰，同时，在多孔淀粉负载的姜黄素中也可观察到1602 cm-1处的峰。表明小麦多孔淀粉可以负载疏水性的药物。

2.8 小麦多孔淀粉负载药物的体外释放

在模拟胃消化液中，负载姜黄素多孔淀粉的释放率见图6（A）。药品的释放率受多孔淀粉的载药量影响较大。多孔淀粉与姜黄素的比例为10:1、20:1、40:1、80:1、160:1 时，2.5 h 的释放率分别为25.25%、28.15%、29.1%、30%、33.8%。

图6 小麦多孔淀粉负载姜黄素在胃液（A）和肠液（B）中的释放Fig.6 Release of wheat porous starch-fixed curcumin by gastric(A) and intestinal (B) fluids

经过胃模拟释放后，负载姜黄素的多孔淀粉再次在模拟肠液中释放，结果见图6（B）。多孔淀粉与姜黄素的比例为10:1、20:1、40:1、80:1、160:1时，姜黄素5 h 的释放率分别为35.58%、37.52%、37.96%、38.21%和42.43%。数据表明，姜黄素在肠道中的释放率增加。胃和肠道的pH 的变化大，从pH2 升到pH6.5，影响了肠道中酶的活性，且在肠道中释放时间为5 h，从而影响了多孔淀粉中药物的释放[28]。

根据文献报道，多孔淀粉可以减缓负载药品的释放[18]。多孔淀粉通常在小肠环境中难以消化，可以成功地将负载的药物输送到结肠中，并被微生物群分解为碳水化合物，最终使负载的药物全部释放[32-33]。

3 结论

本研究用右旋糖酐酶制备小麦多孔淀粉。结果表明，湿热处理可促进右旋糖酐酶制备多孔淀粉，淀粉含水量为30%时，淀粉对酶的敏感性最高。在酶处理16 h 后，多孔淀粉的比容积为2.11±0.021 cm3/g，吸水率和吸油率分别提高到80.12%和78.23%；多孔淀粉对四种不同药物均表现出较好的负载能力。当多孔淀粉与药物的比例为160:1 时，药物负载率均超过了70%。XRD 结果表明，原淀粉和多孔淀粉的结晶型为A 型，酶处理没有改变小麦淀粉的结晶构型；FTIR 图谱显示，原淀粉和多孔淀粉的特征吸收峰没有明显变化，吸附了药物的多孔淀粉显示出药物的特征峰。在胃液中模拟药物释放，2.5 h 的释放率约为30%。在肠液中模拟药物释放，5 h 的释放率约为40%。小麦多孔淀粉负载姜黄素可以显著降低药物的释放。研究结果为制备小麦多孔淀粉提供了实验依据。