不同筋力小麦面筋聚集特性及结构特性分析

邢金金，张霞，母梦羽，田郁，彭瑞芳，冷昱彤，王琦，梁赢，王金水

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

面团的形成是淀粉和面筋蛋白相互作用的结果，面筋蛋白吸水溶胀形成连续的网状结构，而淀粉作为填充材料镶嵌在面筋蛋白的网状结构中[1-2]。面团的加工适宜性是决定面制品品质的关键因素[3]。有研究报道，面团的流变学特性和质构特性对面制品的感官特性和最终产品质量起着重要作用[4]。粉质参数中的面团稳定时间、拉伸参数中的拉伸面积、拉伸比例、最大抗拉伸阻力与面包品质评分呈现极显著相关性[5]。

麦谷蛋白和醇溶蛋白构成小麦的面筋蛋白，其中，醇溶蛋白为单体蛋白，决定面团的黏性和延伸性，可通过分子内二硫键、氢键和疏水作用形成球状结构；麦谷蛋白主要是以聚合体的形式存在，决定面团的弹性和抗延伸性，可通过分子间二硫键的作用形成线性结构。麦谷蛋白依据分子量大小可分为高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunits，HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（low molecular weight glutenin subunits，LMW-GS）[6-10]。有研究表明，蛋白质含量和面筋蛋白含量与面筋蛋白聚集特性有关[11]。面筋蛋白聚集特性受面筋蛋白中醇溶蛋白和麦谷蛋白的含量和比例影响[12]。HMW-GS 在面筋蛋白网络中充当“扩链剂”，与链间二硫键的形成有关，并且HMW-GS 还通过影响面筋蛋白的二级结构来影响面团的最终质量[13]。

面筋蛋白分子通过链内及链间二硫键和多种非共价键交联发生聚集，形成面筋网络结构。麦谷蛋白亚基的游离巯基基团之间发生氧化反应生成二硫键，使不同的亚基通过二硫键连接在一起，使得麦谷蛋白发生聚集，相对分子质量变大。醇溶蛋白通过巯基二硫键交换反应与麦谷蛋白发生交联聚合。面筋蛋白的聚集程度影响面筋及面团的品质特性[11，14]。有研究表明，小麦面筋蛋白聚集程度增强，会形成更加紧密的面筋网络，从而使得面筋的黏弹性及强度有所改善[15]。蛋白质聚集特性对面团流变学特性的影响主要是指谷蛋白大聚体对面团流变学特性的影响，谷蛋白大聚体的含量与面筋含量及面筋指数均呈显著正相关，与面团的形成时间、稳定时间、吸水率、拉伸面积、最大延展阻力均呈显著正相关[16-17]。

国家标准GB/T 17320—2013《小麦品种品质分类》规定，根据小麦籽粒的用途可分为低、中、高筋小麦。相关研究表明，高筋“皖麦38”、中筋“皖麦44”的面团稳定时间显著高于低筋“皖麦48”；高筋“藁麦8901”籽粒中淀粉合成活跃，中筋“豫麦49”和低筋“洛麦1”籽粒中支链淀粉合成比较活跃；相比于低筋“豫麦50”，高筋“郑麦9023”和中筋“豫麦49-986”具有更高的蛋白质含量，具有较优的面粉品质和面团品质；通过添加面筋蛋白可提高小麦粉筋力，改善面团的面筋网络结构，达到改良面包品质的目的[18-22]。较高的面筋蛋白含量不仅可以提高面团的强度、延伸性和弹性，还可以提高面制品的质地、流变性和烘焙质量[23-25]。不同种类的小麦适用于不同的产品类型。低筋小麦粉可用来制作蛋糕、饼干和点心，中筋小麦粉用于制作面条、馒头和饺子，高筋小麦粉适合加工成面包和披萨[26-27]。

目前关于不同筋力小麦面筋蛋白聚集特性及结构特性的差异尚不清楚，因此，本文通过质构仪分析不同筋力小麦面团的质构特性；通过面筋聚集仪分析不同筋力小麦面筋蛋白的聚集特性；通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析面筋蛋白亚基的分子量分布；通过傅里叶红外吸收光谱仪测定面筋蛋白的二级结构；通过激光共聚焦显微镜观察面筋蛋白的微观结构，旨在揭示低筋“郑麦103”、中筋“郑麦136”和高筋“新麦26”3 种筋力小麦面筋蛋白聚集特性和结构特性的差异，以期为深入阐明不同筋力小麦品质特性产生差异的内在机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取在河南黄淮地区种植、2020年收获的3 种不同筋力小麦品种：“郑麦103”（低筋小麦）、“郑麦136”（中筋小麦）、“新麦26”（高筋小麦），放置3 个月后，将低筋、中筋、高筋小麦分别按照14%、14.5%、15%的比例加水进行润麦，24 h 后采用高速多功能粉碎机进行磨粉工序，过100 目筛，小麦粉盛放于排尽空气的双层自封袋中，4 ℃条件下保存备用。

氯化钙、氯化钠、碘、碘化钾（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、三羟甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；β-巯基乙醇、甘油、罗丹明B（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溴化钾（分析纯）：洛阳市化学试剂厂；异硫氰酸荧光素（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

100 型高速多功能粉碎机：永康市松青五金厂；TA.XT Plus 质构仪：英国Stable Micro Systems 公司；803400 面筋聚集仪：德国Brabender 公司；ALPHA 1-2 LD 冷冻干燥机：上海甄明科学仪器有限公司；DYCZ-24DN 电泳仪、WD-9405D 脱色摇床：北京六一生物科技有限公司；X1 台式离心机、CryoStar NX50 旋转低温切片机：赛默飞世尔科技（中国）公司；TENSOR Ⅱ傅里叶变换红外光谱仪：德国布鲁克公司；Olympus Fluoview FV30000 激光共聚焦显微镜：奥林巴斯（北京）销售服务有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦面团的制作

参照Liu 等[28]的方法并稍作修改，准确称取不同筋力的小麦粉各5.0 g，少量多次加入2.2 mL 的蒸馏水，不停搅拌至面粉与水混合成面絮状，开始用力揉捏成均匀且细腻的面团。

1.3.2 小麦粉水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的方法测定小麦粉水分含量。

1.3.3 小麦面团质构特性的测定

参考Liu 等[28]的方法并稍作修改，按照1.3.1 方法制备面团，将制备好的新鲜面团置于内径为2.0 cm、高为1.5 cm 的圆柱形模具中，制成固定形状，将面团从模具中取出，置于质构仪测试平台上，选择质构轮廓分析（texture profile analysis，TPA）模式，使用P/50 探头，参数设置：启动速度1.0 mm/s，试验前后速度均为2.0 mm/s，测试距离为10.0 mm。评价指标：硬度，黏性、弹性、内聚性、胶着性、咀嚼性、回复性。

1.3.4 面筋蛋白聚集特性的测定

参考Malegori 等[29]的方法稍作修改，称取8.5 g 小麦粉分散在9.5 mL 的0.5 mol/L CaCl2溶液中，以水分含量14%为基础，调整溶剂和面粉质量，保持液固比恒定。参数设置：温度35 ℃，转速1 900 r/min，时间300 s。评价指标为最大峰值形成时间（peak maximum time，PMT）、峰值扭矩（maximum time，MT）和聚集能（AgrEn，AgE）。

1.3.5 面筋蛋白含量的测定

参照GB/T 5506.1—2008《小麦和小麦粉面筋含量第1 部分：手洗法测定湿面筋》测定面筋蛋白含量。采用1.3.1 方法制作面团，先用2% NaCl 溶液以50 mL/min 左右的流速不断洗涤面团8.0 min，再用蒸馏水重复以上动作，直至经碘试剂检测洗涤液不再发生颜色变化。将洗涤过的面筋冷冻干燥，置于高速多功能粉碎机中粉碎，过120 目筛，放置备用。

1.3.6 面筋蛋白分子量分布的测定

参照Singh 等[30]的方法并稍作修改，采用SDSPAGE 分析不同筋力小麦面筋蛋白的分子量分布变化。根据面筋蛋白的分子量，分别采用10%（质量浓度）丙烯酰胺分离凝胶和5%（质量浓度）丙烯酰胺浓缩凝胶，用含有1%（质量浓度）十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide，SDS）、5%（体积分数）β-巯基乙醇、10%（体积分数）甘油和0.1%（质量浓度）溴酚蓝的0.01 mol/L Tris-Gly 缓冲液（pH6.8）提取面筋蛋白样品。60.0 mg 面筋蛋白和1.0 mL 的提取液混合均匀，在室温下振荡1.0 h。然后混合物在沸水中煮5.0 min，4 ℃10 000×g离心10.0 min，取15.0 μL 的上层清液添加到泳道中。采用0.1%（质量浓度）考马斯亮蓝R-250 溶液对凝胶进行过夜染色。

1.3.7 面筋蛋白二级结构的测定

参照Skendi 等[31]的方法并稍作修改，以为1∶100 的质量比将样品与KBr 混合均匀，研磨后压制成均匀透明的薄片。参数设置：400～4 000 cm-1全波段扫描，背景扫描64 次，样品扫描32 次，分辨率4.0 cm-1。每个样品做3 个独立的重复试验。利用Peak Fit v4.12 对酰胺Ⅰ带（1 600～1 700 cm-1）分析，去卷积过滤常数和平滑常数分别取值为49.6 和11%，酰胺I 带中各个吸收峰的位置采用二级倒数计算得到。

1.3.8 面筋蛋白微观结构的测定

参照Zhang 等[32]的方法并稍作修改，采用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）分析面筋蛋白的微观结构，将1.3.1 中新鲜的面团样本冷冻，取中间部位用旋转低温切片机切成10.0 mm 的薄片，粘附于显微镜载玻片上。然后用3.5×10-4g/mL异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和1.3×10-5g/mL 罗丹明B 的甲醇溶液避光染色5.0 min，用蒸馏水将载玻片上的染料冲洗干净并晾干。使用ZEN 2012 软件分析以1 024 dpi×1 024 dpi 的分辨率获得的CLSM 图像，以确定面筋蛋白的微观结构。

1.4 数据处理

数据结果用平均值±标准差表示，使用Excel 2016和Origin 2018 进行统计学处理，并用SAS 9.2 对试验数据进行One-way ANOVA 显著性分析，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 面团质构特性分析

面团的质构特性是从物性方面反映面团的内部结构和质量状况，主要包括硬度、弹性、黏性、内聚性、胶着性、回复性以及咀嚼性等指标[33-34]。不同筋力小麦面团的质构特性变化规律见表1。

表1 不同筋力小麦面团的质构特性变化规律Table 1 Texture characteristics of wheat dough with different gluten strengths

由表1 可知，不同筋力小麦面团的硬度、内聚性、胶着性、咀嚼性和回复性都具有显著性差异。随着小麦筋力的增强，面团的硬度、弹性、内聚性、胶着性、回复性和咀嚼性均升高。“郑麦103”面团的硬度、弹性和咀嚼性分别是579.79 g、0.23、34.94 g，“新麦26”面团的硬度、弹性和咀嚼性分别增加到962.07 g、0.42、151.32 g；面团的黏性随着小麦筋力的增强而降低，“新麦26”面团黏性相比于“郑麦103”面团黏性降低了72.7%。内聚性是指形成面团时其内部所需要的结合力，反映面团的抗形变能力，进而反映面筋蛋白的聚集程度。回复性是指试样经过一次压缩后恢复到原始状态的能力，它与面团的弹性有关[35]。随着小麦筋力的增加，“新麦26”面团相比于“郑麦103”面团的内聚性和回复性分别提高了75%、125%。

有研究表明，面筋蛋白含量升高有助于提高面团的弹性。醇溶蛋白和麦谷蛋白的含量和比例决定面团的弹性和延伸性[12]。HMW-GS 中丰富的谷氨酸有助于分子内和分子间氢键的形成，提高面团的黏弹性，LMW-GS 有助于提高面团的面筋强度和弹性[36-38]。不同筋力小麦面团质构特性研究发现，相比于“郑麦103”和“郑麦136”，“新麦26”面团的硬度、弹性及内聚性较高，黏性较低。这可能与不同筋力小麦粉中面筋蛋白的含量、组成和结构有关。

2.2 面筋蛋白聚集特性

面筋聚集仪试验（gluto peak test，GPT）可以快速通过少量的小麦样品检测面筋的聚集特性，从而预测小麦面粉的品质[29]。在测试过程中，扭矩曲线随着面筋网络的形成而增大，达到最大值后面筋网络结构经高剪切后被破坏，扭矩曲线下降[39-40]。不同筋力小麦粉面筋蛋白聚集特性的变化见表2，特性曲线如图1所示。

表2 不同筋力小麦粉面筋蛋白聚集特性的变化Table 2 Changes in aggregation characteristics of wheat gluten flour with different gluten strengths

由表2、图1 可知，随着小麦筋力的增加，最大峰值形成时间明显延长，“郑麦103”、“郑麦136”和“新麦26”的PMT 分别是24.00、37.33、84.00 s。这可能是因为“新麦26”面筋蛋白在发生交联过程中需要形成更多的化学键，需要花费更长的面筋聚集时间。MT 代表破坏面筋网络结构所需要力的大小，可以反映面筋的聚集情况；AgE 有助于增强面团强度[15，29]。“郑麦103”、“郑麦136”和“新麦26”的MT 分别是50.00、43.33、58.67 BU，AgE 分别是1 081.08、987.97、1 617.18 cm2，“新麦26”的MT 和AgE 显著高于“郑麦103”和“郑麦136”。

面筋蛋白分子通过链内及链间二硫键和多种非共价键交联发生聚集，形成面筋网络结构，面筋蛋白的聚集程度影响面筋及面团的品质特性。有研究表明，面筋蛋白聚集能与面筋强度和延展性呈正相关[11]。峰值时间、峰值扭矩和聚集能等面筋聚集仪参数与面团稳定时间、延展性和韧性具有相关性[41]。相比于“郑麦103”和“郑麦136”，“新麦26”具有更长PMT 和更高MT 和AgE，反映了“新麦26”面筋蛋白聚集程度更高，有助于形成更强的面筋网络结构，进而使“新麦26”面团的硬度和弹性增加，内聚性升高，与表1 结果一致。

2.3 面筋蛋白含量

面筋蛋白分子通过链内及链间二硫键和多种非共价键交联发生聚集，面筋蛋白含量影响面筋蛋白的聚集特性[11]，不同筋力小麦面筋蛋白含量见图2。

图2 不同筋力小麦面筋蛋白含量Fig.2 Gluten protein content of wheat with different gluten strengths

由图2 可知，“郑麦103”面筋蛋白含量为7.46%，“郑麦136”面筋蛋白含量为7.69%，“新麦26”面筋蛋白含量为7.98%。随着小麦筋力的提高，面筋蛋白含量逐渐升高。

有研究表明，蛋白质含量和面筋蛋白含量越高，面筋蛋白的峰值扭矩越高，越有利于面筋蛋白的聚集[11]。较高的面筋蛋白含量可提高面团的强度、延伸性和弹性[42]。相比于“郑麦103”和“郑麦136”，“新麦26”面筋蛋白含量增多促进了面筋蛋白的聚集，有助于加强面筋网络结构，进而提高面团的硬度和弹性。这与上述面筋蛋白的聚集特性和面团的质构特性研究结果一致。

2.4 面筋蛋白分子量分布

本研究通过SDS-PAGE 分析不同筋力小麦面筋蛋白分子量分布情况，结果见图3。

图3 不同筋力小麦面筋蛋白分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of gluten proteins of wheat with different gluten strengths

由图3 可知，不同筋力小麦面筋蛋白亚基分子量分布区别很大。随着小麦筋力的增强，面筋蛋白亚基条带颜色加深，表明面筋蛋白各亚基含量增多；“新麦26”面筋蛋白展现出的条带更多，其中分子量分布在25～35 kDa 和48～63 kDa 的LMW-GS 和醇溶蛋白在“新麦26”中明显表达，在“郑麦103”和“郑麦136”中表达较弱，说明与“郑麦103”和“郑麦136”相比，“新麦26”所含的面筋蛋白亚基种类更多。

面筋蛋白亚基通过提供弹性骨架来促进面筋蛋白网络的形成[43]。醇溶蛋白和麦谷蛋白通过分子间二硫键及非共价键相互作用共同决定面团的黏弹性。HMW-GS 中丰富的谷氨酸有利于分子内和分子间氢键的形成，提高面团的黏弹性，LMW-GS 有助于提高面团的面筋强度和弹性[36，38]。所以相比于“郑麦103”和“郑麦136”，“新麦26”面筋蛋白各亚基含量和种类较多，促进了面筋蛋白的聚集，使其形成更强劲的面筋网络结构，进而使“新麦26”面团的硬度和弹性增加，内聚性升高。

2.5 面筋蛋白二级结构

蛋白质二级结构可利用红外光谱图谱的特征吸收谱带酰胺Ⅰ带（1 600～1 700 cm-1）进行分析，酰胺Ⅰ带对蛋白质二级结构的变化较敏感，吸收强度较大[44]。其中酰胺Ⅰ带在1 614～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1为β-折叠结构的特征吸收，1 640～1 650 cm-1为无规则卷曲结构的特征吸收，1 650～1 660 cm-1为α-螺旋结构的特征吸收，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1为β-转角结构的特征吸收[45]。不同筋力小麦面筋蛋白二级结构见表3，酰胺Ⅰ带去卷积示意图及傅里叶变换红外光谱图见图4。

图4 酰胺Ⅰ带去卷积示意图以及傅里叶变换红外光谱特征曲线Fig.4 Deconvolution diagram of amide I band and Fourier transform infrared spectrum characteristic curve

表3 不同筋力小麦面筋蛋白二级结构Table 3 Secondary structures of gluten proteins of wheat with different gluten strengths

由表3、图4 可知，不同筋力小麦面筋蛋白的傅里叶变换红外光谱图的出峰位置和走势基本一致，说明不同筋力小麦面筋蛋白的特定基团没有发生变化，改变的是面筋蛋白二级结构的含量。“郑麦103”、“郑麦136”和“新麦26”面筋蛋白二级结构中β-折叠含量分别是33.19%、35.25% 和36.35%；β-转角含量分别是13.75%、22.84% 和24.89%；α -螺旋含量分别是35.47%、27.50% 和22.53%；无规则卷曲含量分别是17.59%、14.41%和16.23%。随着小麦筋力的增强，面筋蛋白的二级结构中β-折叠和β-转角含量增多，无规则卷曲含量先减少后增加，α-螺旋含量降低。

面粉加水形成面团的过程中，面筋蛋白通过氢键与水分子发生水合作用，形成含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的二级结构，维持面筋网络结构的稳定性[46]。α-螺旋是一种软性结构，具有一定的灵活性，与面团弹性呈负相关；β-折叠是一种刚性结构，稳定性较强，β-折叠和β-转角与面团的稳定性和延展性有关；无规则卷曲是一种能量较低的无序结构[47-48]。“郑麦103”面筋蛋白的二级结构中α-螺旋含量高，β-折叠和β-转角含量低，导致面筋结构稳定性较差，灵活性较高。“新麦26”面筋蛋白的二级结构中β-折叠含量高，无规则卷曲含量低，这使得“新麦26”获得更加稳定的面筋蛋白网络结构。

2.6 面筋蛋白微观结构

小麦面团形成过程中，面筋蛋白分子发生聚集，形成面筋网络结构，淀粉颗粒镶嵌于面筋网络结构空隙中，形成具有一定黏弹性的小麦面团。本研究进一步通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察不同筋力小麦面筋微观结构，结果见图5。

图5 小麦面筋微观结构Fig.5 Microstructures of wheat gluten

由图5 可知，“郑麦103”的面筋网络结构松散且连续性差，空隙大，面筋蛋白与淀粉结合程度低；相比之下，“郑麦136”的面筋网络较“郑麦103”的更致密，连续性更好，空隙较小，面筋蛋白与淀粉结合程度较高；“新麦26”具有连续性最好且最为致密的面筋网络结构，空隙最小，面筋蛋白可紧密包裹淀粉颗粒。

“新麦26”具有更高的MT 和AgE，反映了面筋的聚集程度更高，这与“新麦26”面筋蛋白连续性最好的结果是一致的。“新麦26”面筋蛋白二级结构中β-折叠含量高，无规则卷曲含量低，反映了面筋蛋白网络结构更稳定，这与“新麦26”面筋网络结构最致密的结果是一致的。故小麦的筋力越强，面筋蛋白聚集程度越高，形成的面筋网络结构越致密，面筋结构的稳定性越强，与淀粉结合程度越高，进而使“新麦26”面团的硬度和弹性增加，内聚性升高。

3 结论

本研究分析了“郑麦103”（低筋）、“郑麦136”（中筋）、“新麦26”（高筋）3 种不同筋力小麦面团的质构特性和面筋蛋白的聚集特性、面筋蛋白含量、分子量分布、二级结构及微观结构。研究结果表明，与“郑麦103”和“郑麦136”相比，“新麦26”面团的硬度、弹性及内聚性较高，黏性较低。“新麦26”具有更长的最大峰值形成时间和更高的峰值扭矩及聚集能，更高的峰值扭矩和聚集能，表明“新麦26”比“郑麦103”和“郑麦136”的面筋蛋白更容易发生聚集。与“郑麦103”和“郑麦136”相比，“新麦26”的面筋蛋白含量更高，面筋蛋白各亚基含量更高，面筋蛋白亚基种类更多。随着筋力的增强，面筋蛋白二级结构中β-折叠和β-转角逐渐增多，无规则卷曲含量先减少再增加，α-螺旋逐渐减少，使得“新麦26”面筋蛋白结构的稳定性增强。小麦筋力越强，面筋蛋白网络结构连续性越好，包裹淀粉能力越强。综上所述，相比于低筋小麦“郑麦103”和中筋小麦“郑麦136”，高筋小麦“新麦26”面筋蛋白含量较高，面筋蛋白亚基种类较多，可促进面筋蛋白的聚集，面筋蛋白中增多的β-折叠结构提高了面筋蛋白结构的稳定性，面筋网络结构的连续性增强，进而提高了面团的强度和弹性。