ESD 对结直肠神经内分泌肿瘤患者疗效的影响及Akt/mTOR 信号途径参与机制研究

牛振楠，梁冬红，刘 壮，孟嫦娟

神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasm，NEN）作为异质性肿瘤，起源于神经内分泌细胞，发病率较低，但随着影像学和临床诊断技术不断提高，其检出率和发病率呈现逐年增加趋势， 常见于结直肠等部位[1，2]。 NEN 的发病较为复杂[3，4]，可能与遗传、饮食和生活习惯相关，主要临床症状为局部肿块、头痛、视野模糊等压迫症状及肌无力、 醛固酮增多等神经内分泌症状，严重威胁患者生命安全。 现阶段临床治疗NEN 以手术、化学治疗、放射治疗及靶向治疗为主，并根据肿瘤分型、分期、发生部位等选择适宜手段，且手术为首选方案[5]。 常规开腹切除因切口大、术后恢复慢，已逐渐被临床摒弃[6]；内镜切除术，如内镜下黏膜切除术（endoscopic mucosal resection，EMR）可有效切除病灶，阻止癌变病灶的进展或转移，但其在切除直径＞2 cm 病灶方面存在一定局限性[7]。 内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）是在EMR 的基础上发展而来的手术方式， 可完整切除病灶，降低复发率[8]，且已用于胃肠NEN 患者[9]，但具体应用于结直肠部位肿瘤研究及作用机制相对较少。因此笔者选择146 例结直肠NEN 患者， 采用随机信封法， 研究ESD 和常规内镜切除术对患者临床疗效及作用机制，为临床控制疾病进展、延长生存期等提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2014 年1 月至2019 年10 月在邢台市第三医院收治的146 例结直肠NEN 患者， 其中男性92例，女性54 例；年龄42 ～65 岁，平均年龄53.49 岁（标准差5.42 岁）；病灶直径1.15 ～1.85 cm，平均直径1.50 cm（标准差0.18 cm）；病理分级[10]，G132 例，G251 例，G363 例；直肠99 例，结肠47 例。 按随机信封法将患者分成观察组和对照组，每组73 例。对照组患者行EMR，观察组行ESD。 观察组男性49 例，女性24 例；年龄42 ～65 岁，平均年龄53.15 岁（标准差5.50 岁）；病灶直径1.16 ～1.82 cm，平均直径1.47 cm（标准差0.18 cm）； 病理分级，G114 例，G224 例，G335 例；直肠47 例，结肠26 例。 对照组男性43 例，女性30 例；年龄44 ～62 岁，平均年龄52.87 岁（标准差4.52 岁）；病灶直径1.16 ～1.84 cm，平均直径1.49 cm（标准差0.20 cm）； 病理分级，G118 例，G227 例，G328 例；直肠52 例，结肠21 例。

选择标准：①均经病理组织检查确诊为NEN，且发病部位为结直肠[11]；②年龄18 ～75 岁；③均符合手术治疗诊断，首次应用内镜切除术或ESD；④入院前未经放化疗等治疗；⑤患者首次发病，病历资料齐全，能正常沟通和交流；⑥知情同意研究方案。

排除标准：①合并恶性肿瘤者；②凝血功能障碍、出血性疾病者；③红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫疾病者；④肝、肾、心等重要脏器衰竭者；⑤不配合者。

两组患者性别、年龄、病理分级、病灶部位及病灶直径比较，差异无统计学意义（χ2/t=1.058、0.336、1.454、0.784、0.635，P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

手术由同一手术团队进行，所有患者术前均进行手术指征确认。 术前禁饮、禁食至少6 h，并于术前给予镇静剂和解痉剂，在静脉麻醉下行相应手术治疗。

观察组：给予常规ESD 治疗。 具体步骤如下：采用日本Olympus CF-H260AI 型电子肠镜判断、 勾画病灶， 并应用DUAL 刀在病灶区域0.5 cm 外沿电凝法标记；在病灶周边注射混合液，主要为甘油果糖、肾上腺素和由美蓝， 每次注射3 mL， 等待病灶肌层分离；再次应用DUAL 刀沿着标记点边缘逐步切开，在钩刀的辅助下在黏膜下层沿着原有基层剥离病灶黏膜，将完整瘤体送检，同时确认基底和边沿是否有肿瘤残留物；彻底剥离后，应用热活检钳充分止血，降低活动性出血事件发生。

对照组：给予常规EMR 治疗。 在内镜的辅助下充分暴露病灶基底，并探查病灶。 在病灶周边注射混合液，主要为甘油果糖、肾上腺素和由美蓝，关注病灶的抬举征是否为阳性，选用适宜大小的圈套器对阳性病灶圈套，并应用电凝刀切除，针对体积较大的病灶可分批次切除，最后应用热活检钳行相应创面关闭处理，以发挥止血功能。

术后24 h 密切监测患者生命体征，并给予止血、抑酸及抗感染等，于术后3、6、12 个月定期复查。

1.2.2 观察指标

病变切除情况：记录两组患者治愈性切除、整块切除及基底病灶残余等情况。

手术情况：记录两组患者术中出血量、手术时间、住院时间、治疗费用、病变组织直径及病变组织厚度等。

生存质量：于术前和术后7 d 应用生存质量量表评估两组患者生存质量[12]。 该量表包括食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等6 个维度，除生活能力每个维度满分为5 分， 生活能力满分为20 分。 分值越高，患者生存质量越差，该量表Cronbach’α 为0.789，信效度较好。

免疫功能：分别于术前和术后7 d 采集空腹肘静脉外周血4 mL，流式细胞仪检测两组患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指标。

蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）：分别术前和术后7 d 采集空腹肘静脉外周血4 mL，采用德国Hettich MIKRO220 型离心机，参数：3000 r/min，半径8 cm，时间10 min，温度-4 ℃；上清液为目标产物，应用美国Bio 公司Tek Synergy H1MF 型号全自动酶标仪，波长为450 nm，测定血清Akt 和mTOR 水平，所有操作均严格按照说明书进行。

并发症： 记录两组患者围术期并发症发生情况，如术中穿孔、皮下气肿及术后迟发性出血等情况。

复发情况：随访1 年，记录两组患者术后1 年复发情况。

诊断效能分析：以术后7 d 血清Akt 和mTOR 为检验变量，以术后是否复发为状态标量，绘制受试者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线，绘制曲线下面积（area under curve，AUC），分析Akt 诊断、mTOR 诊断和二者联合诊断的灵敏度、特异度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。 计量资料符合正态分布，以均数± 标准差表示，组间行独立样本t 检验，治疗前后行配对t 检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。 P ＜0.05 为差异有统计学意义，P ＜0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者病变切除情况比较

术后观察组患者治愈性切除率和整块切除率明显高于对照组[83.56 %（61/73） vs 60.27 %（44/73）。χ2=9.801，P=0.002。 97.26%（71/73）vs 73.97%（54/73）。 χ2=16.074，P=0.000]，而两组患者基底病灶残余率差异无统计学意义[1.37%（1/73）vs 5.48%（4/73）。χ2=1.864，P=0.172]。

2.2 两组患者手术情况比较

观察组患者手术时间和治疗费用明显高于对照组，而术中出血量和住院时间明显低于对照组（P ＜0.05）。 两组患者病变组织直径和病变组织厚度比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。 见表1。

2.3 两组患者手术前后生存质量比较

术前两组患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存质量各维度差异无统计学意义 （P ＞0.05）；术后7 d 两组患者生存质量各维度水平明显降低（P ＜0.05），且观察组患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存质量评分明显低于对照组（P ＜0.05）。 见表2。

2.4 两组患者手术前后免疫功能比较

术前两组患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指标差异无统计学意义（P ＞0.05）。 术后7 d，两组患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明显提高，CD3+CD8+水平明显降低（P ＜0.05）；且观察组患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明显高于对照组，CD3+CD8+水平明显低于对照组（P ＜0.05）。 见表3。

表3 两组患者手术前后免疫功能比较Tab.3 Comparison of immune function before and after treatment between 2 groups before and after operation

2.5 两组患者手术前后Akt 和mTOR 比较

术前两组患者血清Akt 和mTOR 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；术后7 d，两组患者血清Akt和mTOR 明显降低（P ＜0.05），且观察组患者血清Akt和mTOR 明显低于对照组（P ＜0.05）。 见表4。

表4 两组患者手术前后血清Akt 和mTOR 比较ng/mLTab.4 Comparison of Akt and mTOR between 2 groups before and after operationng/mL

2.6 两组患者术后并发症比较

观察组术后迟发性出血1 例（1.37%），穿孔2 例（2.74%），皮下气肿1 例（1.37%）。 对照组术后迟发性出血4 例（5.48%），穿孔4 例（5.48 %），皮下气肿5例（6.85%）。 两组患者均出现术后迟发性出血、穿孔及皮下气肿等并发症，但差异无统计学意义（χ2=1.864、0.695、2.781，P=0.172、0.404、0.095）。

2.7 两组术后复发情况比较

随访1 年，失访3 例。观察组患者复发率为4.17%（3/72），明显低于对照组的22.54%（16/71），差异有显著统计学意义（χ2=10.469，P=0.001）。

2.8 单独和联合诊断效能比较

血清Akt 临界值为1.33 ng/mL，Akt 诊断的灵敏度为68.42%，特异度为70.16 %，AUC 为0.765[95%可信区间（confidence interval，CI）0.706 ～0.813]；血清mTOR 临界值为0.049 ng/mL，mTOR 诊断的灵敏度为73.68%， 特异度为59.89%，AUC 为0.808 （95%CI0.749 ～0.851）；二者联合诊断，其灵敏度为84.21 %，特异度为75.00%，AUC 0.878（95%CI 0.832 ～0.911）。见图1。

图1 Akt 诊断、mTOR 诊断和二者联合诊断的ROC 曲线Fig. 1 ROC curves of Akt diagnosis, mTOR diagnosis and combined diagnosis

3 讨论

NEN 起源于弥散神经内分泌系统， 可分布于全身不同器官和组织，以胃肠道等消化系统最为常见，以低血糖、皮肤潮红、胰高糖素瘤及生长抑素瘤等为主要临床症状，其生长缓慢、恶性程度低，若早期及时发现并对症治疗，将会明显改善患者预后[13，14]。现阶段[15]，NEN 未见有效预防措施，手术是根治NEN 最有效的方式，传统息肉切除术完全切除率仅为30%～50%，不仅存在较高复发率，而且具有创伤大、恢复慢等缺点，患者依从性较低。随着内镜技术应用于外科手术，EMR 的肿瘤清除率明显高于传统开腹手术， 术中损伤、侵袭小，术后并发症发生率低，其安全性和有效性已得到临床广泛证实，但其在切除大体积病灶方面存在不足[16]。ESD 是在内镜直视下应用专用医疗器械将病灶剥离正常黏膜，以彻底清除病灶、遏止疾病复发[17]，二者在NEN 治疗中均有一定作用，但在治疗效果、优势和缺点等方面临床尚未得出统一结论。有研究[18]证实，NEN 患者3 年生存率仅为52.64 %，预后较差。因而研究治疗方式的作用机制，对疾病复发、预后的改善具有重要临床意义。

ESD 在治愈性切除率、整块切除率、生存质量和免疫功能提高等方面独具优势， 但ESD 手术时间和治疗费用高于EMR。 Dinc S 等[19]大鼠实验表明，ESD后创面比EMR 损伤大，手术时间较长。 ESD 可在内镜的帮助下， 应用专用医疗器械完全剥离病灶组织，而病灶的完全剥离与疾病复发、免疫功能和生存质量明显相关。 贺德志等[20]证实，ESD 可有效提高病理组织切除率， 降低并发症， 但术后复发率仍较高，为23.64%，略高于笔者研究，可能与样本量、手术方式相关。Akt 是高度保守的蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）的下游因子；mTOR 是Akt 信号下游作用靶点， 可直接磷酸化或者阻滞结节性硬化复合物， 以激活mTOR信号通路，Akt/mTOR 信号通路的激活与肿瘤细胞的增殖、分化密切有关[21]。笔者研究结果表明，两组患者血清Akt 和mTOR 明显降低，且观察组患者血清Akt和mTOR 明显低于对照组（P ＜0.05），即临床切除结直肠NEN，提高临床疗效、改善患者生存质量与降低Akt/mTOR 信号通路相关，且Akt 和mTOR 单独和二者联合检测可应用于预测结直肠NEN 术后复发，临床可通过术后Akt 和mTOR 指标预测疾病复发。

综上所述，ESD 应用于治疗结直肠NEN 患者可有效提高治愈性切除率和整块切除率，改善患者生存质量，恢复免疫功能，降低术后1 年复发率，且血清Akt 和mTOR 单独和二者联合诊断可应用于预测结直肠NEN 术后复发。