脑心清片质量标准提升

刘傲雪，冯文明，张 甦

［鉴甄检测技术（上海）有限公司，上海 200131］

柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的叶作为中药使用，始见于《滇南本草》，《本草再新》［1］记载其可用于“治咳嗽吐血，止渴生津”。脑心清片是以柿叶为原料制成的薄膜衣片，主要成分包括黄酮、三萜、酚酸，其中黄酮占总含量的25.7%［2-4］，该制剂具有活血化瘀、通络的功效，用于治疗脉络瘀阻、眩晕头痛、肢体麻木、胸痹心痛、胸中憋闷、心悸气短、冠心病、动脉粥样硬化症等见上述证候者，主要有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡［5］、改善血流动力学和血液流变学、抑制血小板和血栓形成、抗心肌缺血、抗脑缺血等作用［6-8］，对脑动脉硬化［9-10］、脑卒中及其后遗症疗效显著［11-12］。

目前，关于脑心清片质量标准的研究涉及黄酮含量测定、指纹图谱等［13-16］，并且已收载于2020年版《中国药典》［17］中，但缺乏黄酮特征鉴别和多成分质控手段。因此，本实验通过TLC 鉴别、特征图谱、含量测定来提升脑心清片质量标准，以期为有效控制该制剂品质提供可靠的方法。

1 材料

ATS 4 全自动点样仪、Visualizer 2 薄层色谱数码成像系统（瑞士Camag 公司）； Waters Aquility UPLC H-class 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； Schmidbauer GmbH／P300H 超声波清洗仪（德国Elma 公司）； MS204TS／02、XSE105DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。金丝桃苷（批号111521-201809）、异槲皮苷 （批号111809-201804）、紫云英苷（批号10319）、槲皮素（批号100081-201610）、山柰酚 （批号110861-202013）对照品分别购自中国食品药品检定研究院、上海诗丹德生物技术有限公司。脑心清片共15 批，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，规格包括0.41 g／片（含柿叶提取物50 mg）、0.41 g／片（含柿叶提取物100 mg）。流动相用乙腈（上海阿达玛斯试剂有限公司）、磷酸（美国Fisher 公司）为色谱纯； 供试品溶液制备、TLC 展开剂用甲醇、无水甲酸、二氯甲烷为分析纯； 水为超纯水（由Master Touch-DUVF 超纯水机制备）。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别 取本品适量（相当于柿叶提取物125 mg），加20 mL 水超声提取15 min，离心10 min，上清液用二氯甲烷萃取2 次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加1 mL 甲醇，作为供试品溶液； 取山柰酚对照品适量，甲醇制成每1 mL含0.5 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液［6］。吸取上述2 种溶液各10 μL，分别点于同一高效硅胶GF254 薄层板上，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶15）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯（254 nm）下检视，结果见图1。由此可知，供试品、对照品溶液色谱图同一位置处显示相同颜色斑点。

2.2 特征图谱建立

2.2.1 色谱条件、系统适用性试验 参考文献［7-8］报道，Agilent Zorbax Eclipse plus C18色谱柱（10 cm×2.1 mm，1.8 μm）； 流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～30 min，5% ～40%A；30～32 min，40% ～95% A； 32 ～34 min，95% A；34～35 min，95% ～5%A； 35 ～40 min，5%A）； 体积流量0.3 mL／min； 柱温35 ℃； 检测波长254 nm； 进样量2 μL。理论塔板数按槲皮素计，应不低于8 000。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 该成分的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品10 片 （批号I20A004），研细，取约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声（380 W、37 kHz）处理15 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备 取阴性样品适量，按“2.2.3” 项下方法制备，即得。

2.2.5 标准规定 供试品溶液特征图谱中应呈现12 个特征峰，以槲皮素色谱峰为S 峰，其中11 号峰保留时间应与对照品溶液色谱峰的相对应，各特征峰相对保留时间应在规定值的±5% 以内，分别为0.16 （峰1）、0.27 （峰2）、0.41 （峰3）、0.51 （峰4）、0.63 （峰5）、0.65 （峰6）、0.68（峰7）、0.70 （峰8）、0.74 （峰9）、0.78 （峰10）、1.19 （峰12）。

2.2.6 专属性试验 供试品溶液特征图谱中有12个特征峰，经对照品比对，峰1 为原儿茶酸，峰2为对羟基苯甲酸，峰5 为金丝桃苷，峰6 为异槲皮苷，峰9 为紫云英苷，峰11 为槲皮素，峰12 为山柰酚，阴性无干扰，表明专属性符合规定，见图2。

图2 脑心清片特征图谱Fig.2 Characteristic chromatogram of Naoxinqing Tablets

2.2.7 重复性试验 取装量差异下的本品（批号I20A004），研细，取约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，以槲皮素特征峰为参照峰，测得各特征峰相对保留时间RSD 在0.02% ～0.08% 范围内，相对峰面积 RSD 在1.34% ～2.30%范围内，表明重复性符合规定。

2.2.8 中间精密度试验 由不同分析人员在不同检验日期使用不同仪器，对同一批样品 （批号I20A004）平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得各特征峰相对保留时间RSD 在0 ～1.36% 范围内，相对峰面积RSD 在2.13% ～17.65% 范围内，表明中间精密度符合规定。

2.2.9 稳定性试验 取供试品溶液 （批号I20A004）适量，室温下于0 ～24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各特征峰相对保留时间RSD 在0.16% ～2.27%范围内，相对峰面积RSD 在0.28% ～3.03%范围内，表明稳定性符合规定。

2.2.10 结果分析 采用上述方法建立15 批样品特征图谱，以槲皮素特征峰为参照峰，测得12 个共有峰在所有样品色谱图中均出现，特征峰相对保留时间均在规定值的±5%以内。

2.3 含量测定 采用HPLC 法。

2.3.1 色谱条件、系统适用性试验 同“2.2.1” 项。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含金丝桃苷9 μg、异槲皮苷14 μg、紫云英苷16 μg、槲皮素9 μg、山柰酚12 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 同“2.2.3” 项。

2.3.4 线性关系考察 精密称取对照品溶液（金丝桃苷0.498 mg／mL、异槲皮苷0.510 mg／mL、紫云英苷0.503 mg／mL、槲皮素0.521 mg／mL、山柰酚0.495 mg／mL）适量，甲醇制成系列质量浓度，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各黄酮在各自范围内线性关系良好。

表1 各黄酮线性关系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.3.5 重复性试验 取装量差异下本品（批号I20A004），研细，取约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得各黄酮含量RSD 在0.50% ～1.94%范围内，表明重复性符合规定。

2.3.6 中间精密度试验 由不同分析人员在不同检验日期使用不同仪器，对同一批样品 （批号I20A004）平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮含量RSD 在0.41% ～2.75%范围内，重复性、中间精密度含量RSD 在0.10% ～1.74%范围内，表明中间精密度符合规定。

2.3.7 稳定性试验 取供试品溶液 （批号I20A004）适量，室温下于0 ～24 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得各黄酮色谱峰保留时间RSD 在0.74% ～1.37% 范围内，峰面积RSD 在0.22% ～0.67%范围内，表明稳定性符合规定。

2.3.8 加样回收率试验 取各黄酮含量已知的本品（批号I20A004）约0.1 g，精密称定，平行6份，置于具塞锥形瓶中，精密加入金丝桃苷对照品溶液（0.099 6 mg／mL）1 mL、异槲皮苷对照品溶液（0.102 mg／mL）2 mL、紫云英苷对照品溶液（0.101 mg／mL）2 mL、槲皮素对照品溶液（0.104 mg／mL）1 mL、山柰酚对照品溶液 （0.099 1 mg／mL）2 mL，加70%甲醇至25 mL，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，金丝桃苷平均加样回收率为101.43%，RSD 为2.21%； 异槲皮苷平均加样回收率为102.16%，RSD 为2.31%；紫云英苷平均加样回收率为95.38%，RSD 为1.48%； 槲皮素平均加样回收率为105.16%，RSD为1.43%； 山柰酚平均加样回收率为104.48%，RSD 为0.73%。

2.3.9 样品含量测定 取 15 批样品，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各黄酮含量测定结果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various flavonoids （mg／g）

3 讨论

本实验对供试品溶液制备方法、展开剂、检视方法、点样量等方面进行考察，确定TLC 鉴别条件，再进行方法学考察，包括专属性、稳定性等，发现均符合要求。另外，15 批脑心清片经检测均符合起草标准，表明该方法专属性强，稳定性好，可实现有效成分鉴别的目的。

然后，将特征图谱和含量测定相结合，采用同一液相体系兼顾有效成分定性、定量分析。结果，特征图谱中保留时间10 min 前的成分大多为有机酸，12 min 后大多为黄酮，其中黄酮苷极性大于苷元，出峰更靠前，于12～16 min 集中出峰，而苷元出峰在18 min 后。再进行体系耐用性探索，发现不同柱温 （33、35、37 ℃）、体积流量 （0.2、0.3、0.4 mL／min）、盐体系 （0.05%、0.1% 磷酸）、色谱柱下各黄酮色谱峰峰面积RSD 均小于4%，表明该方法稳定，重复性、耐用性良好。

含量测定结果显示，各黄酮总含量稳定，但随着工艺变动（企业中试生产批次）黄酮苷、苷元比例发生变化。若含量测定仅限定于个别黄酮类成分［18-20］则会相对片面，而本实验对该类成分的质量控制更完善、稳定。

4 结论

本实验通过增加TLC 鉴别、特征图谱、含量测定项目，进一步提升了脑心清片质量标准。在2020 年版《中国药典》 基础上，新增的TLC 法弥补了脑心清片中黄酮类特征成分的鉴别项； 特征图谱中12 种成分可对该制剂特征峰进行监控； 含量测定在原有的槲皮素、山柰酚2 种黄酮苷元基础上，又增加了3 种黄酮苷（金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷），可对其进行更全面的质量控制。