一测多评法测定大花龙胆中环烯醚萜类和黄酮类成分的含量

李灿琳，刘海洋，李 思，李廷菊，黄 茜，古 锐*

1.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137

2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

大花龙胆GentianaszechenyiiKanitz 收载于《四川省藏药材标准》“白花龙胆（榜间嘎保）”项下，入药部位为除去基生叶的带花地上部分。大花龙胆味苦，性凉，具有解毒、利咽的功效，是白花龙胆的主流药材[1-3]，临床上治疗哮喘、急慢性咽喉炎、急慢性支气管炎等疾病效果明显。由于市场需求量大，资源紧缺，目前已被列入一级濒危藏药。指纹图谱研究表明，大花龙胆主要成分包括以大花龙胆苷A、平龙胆酯苷、马钱苷酸、獐芽菜苷、乌奴龙胆苷D 等为主的环烯醚萜类和以异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷（或称为异金雀花素苷）、异金雀花素为代表的黄酮类成分。目前，在四川省藏药材标准（2020年版）中，建立了大花龙胆苷A 的含量测定方法，缺陷在于不能很好地控制药材中多种成分的质量；受需要对照品的数量和种类较多，成本高且部分对照品未有出售的影响，外标法存在一定局限性，并不适宜于民族地区药检系统检测需要[4-5]。为更好地控制藏药大花龙胆的质量，本研究提出采用“一测多评法”[6-11]，此法已广泛应用于藏药的质量控制。通过一测多评技术实现同时测定大花龙胆中的多个指标性成分，为提升大花龙胆药材的质量控制标准提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260A 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；岛津LC2030 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SB-5200DT 超声清洗仪器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UPT-11-10T 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；CAP2250 赛多利斯电子分析天平（白山市玖久仪器仪表有限公司）。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。对照品马钱苷酸（批号PS000658，质量分数≥98%）、獐牙菜苷（批号PS011123，质量分数≥98%）、异金雀花素（批号PS010491，质量分数≥98%）、乌奴龙胆苷D（批号PS010489，质量分数≥98%）、平龙胆酯苷（批号PS010487，质量分数≥98%）购自成都普思生物科技股份有限公司。异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、大花龙胆苷A 为成都中医药大学民族医药学院自制，经峰面积归一化法计算质量分数为98%以上。24 批大花龙胆药材自采或购买于西藏、青海、四川等地，经成都中医药大学民族医药学院古锐教授鉴定为大花龙胆G.szechenyiiKanitz 的干燥花枝，见表1。

表1 24 批样品来源信息Table 1 Source information of 24 batches of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%磷酸水溶液（A 相），甲醇（B 相），梯度洗脱：0～5 min，20%～27% B；5～12 min，27% B；12～55 min，27%～45% B；55～62 min，45%～48% B；62～82 min，48%～56% B；82～85 min，56% B；85～90 min，56%～20% B；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长254 nm；柱温35 ℃，色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液 (A) 和大花龙胆样品 (B) HPLC 图Fig.1 HPLC chromatographs of mixed reference substances (A) and sample of G.szechenyii (B)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品马钱苷酸17.09 mg、獐牙菜苷17.92 mg、异荭草苷17.20 mg、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷20.24 mg、异金雀花素16.78 mg、乌奴龙胆苷D 17.82 mg、平龙胆酯苷19.15 mg、大花龙胆苷A 67.27 mg 分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇至相应刻度，摇匀。分别精密移取上述8 个对照品溶液适量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为153.90、71.68、51.60、253.00、178.13、89.10、143.63、605.43 mg/L 的混合对照品溶液。于4 ℃冰箱避光保存，备用，滤过，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过3 号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）30 min，取出，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围考察 精密吸取上述混合对照品溶液，加甲醇稀释制成系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件下测定其峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，各待测对照品浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程和线性相关系数（R2），结果R2均大于0.999，表明进样浓度与峰面积有良好的线性关系，见表2。

表2 大花龙胆中8 种成分的线性回归方程Table 2 Linear regression equations of eight components in G.szechenyii

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次进行分析，每次进样10 μL，记录大花龙胆苷A、马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷的峰面积，计算峰面积的RSD 值，结果显示上述各成分的峰面积RSD 分别为0.87%、0.76%、0.47%、0.89%、0.90%、0.88%、0.69%、0.82%，说明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取大花龙胆药材（DH6），按“2.3”项下制备供试品溶液，置于室温下，分别于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h 进样，记录峰面积，结果大花龙胆苷A、马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷的峰面积RSD 别为0.87%、0.52%、1.35%、0.97%、0.80%、0.77%、1.10%、0.74%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取大花龙胆药材（DH6），按照“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，依照“2.1”项下条件进样，测定马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷、大花龙胆苷A 的平均含量分别为2.668、0.782、1.227、9.560、6.719、1.395、1.852、13.962 mg/g，RSD 值分别为1.20%、1.02%、0.65%、0.75%、0.49%、0.38%、0.91%、0.64%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取0.25 g 已知含量的大花龙胆药材粉末（DH6）6 份，加入一定量混合对照品溶液适量（相当于药材中各被测成分含量的100%），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算大花龙胆苷A、马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷的平均回收率分别为99.65%、96.51%、100.87%、96.65%、99.82%、99.84%、103.33%、100.91%；RSD 分别为1.66%、2.36%、1.90%、1.34%、1.77%、1.63%、2.24%、2.45%。

2.5 相对校正因子（fs/i）的计算

采用多点矫正法，取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样2、4、6、8、10、15 μL，以大花龙胆苷A 和异荭草苷为内参物，分别计算大花龙胆苷A 对马钱苷酸、獐牙菜苷、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷的相对校正因子（f）和异荭草苷对异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素的f，见表3、4。

表3 大花龙胆中环烯醚萜类的相对校正因子Table 3 RCF of iridoids in G.szechenyii

表4 大花龙胆中黄酮类的fs/iTable 4 RCF of flavonoids in G.szechenyii

fs/i＝fs/fi=(As×Ci)/(Cs×Ai)

As为内参物s 峰面积，Cs为内参物s 浓度，Ai为待测成分i峰面积；Ci为待测成分i浓度。

2.6 fs/i 的耐用性考察

2.6.1 不同高效液相色谱仪和色谱柱对fs/i的影响 试验考察了仪器安捷伦1260、岛津LC2030 2种不同的高效液相色谱系统和Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SWELL-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Comatex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Sepax GP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4 种不同的色谱柱，对大花龙胆中6 种有效成分马钱苷酸、獐牙菜苷、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素的fs/i的影响，结果各成分的RSD 值＜5.0%，表明fs/i在不同的色谱柱和仪器下具有较好的适用性，见表5。

表5 不同仪器和色谱柱对大花龙胆中各成分的fs/i 影响Table 5 Effects of different columns and different instruments on RCF of ingredients in G.szechenyii

2.6.2 柱温对fs/i的影响 其他色谱条件不变，在不同柱温(30、35、40 ℃)下测定马钱苷酸、獐牙菜苷、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素的fs/i，RSD 分别为0.57%、1.47%、0.30%、2.93%、0.99%、0.27%，说明不同柱温对fs/i的影响无显著性差异。

2.6.3 不同体积流量对fs/i的影响 其他色谱条件不变，在不同体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）测定马钱苷酸、獐牙菜苷、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素的fs/i，RSD 值为0.34%、1.53%、0.91%、3.38%、0.18%、0.58%，说明不同体积流量下fs/i具有良好适用性。

2.7 一测多评法（ quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）中待测成分色谱峰定位

本研究采用相对保留时间（ti/s）进行待测成分色谱峰的定位，分别计算马钱苷酸、獐牙菜苷、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷对参照物大花龙胆苷A 的相对保留时间（tR）以及异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素对参照物异荭草苷的tR，对各成分进行色谱峰定位。结果如表6 所示，各成分tR的RSD 均小于5%，表明可利用tR对各成分进行定位。

表6 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值Table 6 Relative retention time of different columns and different instruments

2.8 QAMS 与外标法（external standard method，ESM）的比较

分别精密吸取24 批供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。采用ESM 和QAMS 计算药材中大花龙胆苷A、马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷的含量，结果见表7。结果表明，2 种方法测得的含量无显著性差异，表明建立的QAMS 在环烯醚萜成分与黄酮类成分检测中的适宜性良好，可为大花龙胆的多指标质量控制标准提供理论参考。

表7 QAMS 与ESM 测得24 批大花龙胆中5 种环烯醚萜类和3 种黄酮类的含量Table 7 Content of five iridoids and three flavones in 24 batches of G.szechenyii by QAMS and ESM

2.9 结果与分析

将24 批不同产地药材高相液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）中，以DH6 药材色谱图为参照色谱，构建指纹图谱并进行相似度分析（图2）。结果发现24 批大花龙胆共有12 个共有峰，保留时间分别为9.934、16.927、28.806、30.25、37.618、40.509、53.446、55.202、65.426、74.451、77.451、81.102 min。24 批大花龙胆药材与DH6 的相似度在0.956～1.000，这表明不同产地的大花龙胆药材具有较高的一致性24 批药材叠加图谱见图2。以8 个有效成分含量作为评价指标，运用 GraphPad Prism 进行热图分析，见图3。

图2 24 批大花龙胆药材HPLC 图Fig.2 HPLC chromatograms of 24 batches of G.szechenyii

图3 不同产地成分差异热图Fig.3 Heat map of ingredients of different producing areas

由图3 可知，大花龙胆中有效成分含量差异显著，大花龙胆苷A 含量显著高于其他成分，而獐芽菜苷显著低于其他成分。结合含量测定结果发现，DH13（四川省阿坝州若尔盖日尔郎山2 号大桥）样品中各成分（马钱苷酸、乌奴龙胆苷D 除外）的质量分数均显著低于其他产地，分别为1.725、0.125、0.920、1.434、2.710、1.891、0.495、5.943 mg/g。马钱苷酸、獐芽菜苷、异金雀花素、大花龙胆苷A含量最高的批次均为DH4（质量分数分别为7.911、1.779、8.586、31.593 mg/g）；异荭草苷含量最高的批次为DH14（2.28 mg/g），与最低的DH13（0.920 mg/g）相差2.48 倍；异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷含量最高的批次为DH24，与最低的DH13（1.437 mg/g），相差7.76 倍；乌奴龙胆苷D 含量最高的批次为DH19（4.765 mg/g），与最低的DH6（1.337 mg/g）相差3.56 倍；平龙胆酯苷含量最高的批次为DH3，与最低的DH13（0.502 mg/g）相差10.96 倍。综上所述，不同产地样品中成分含量差异十分显著，四川省甘孜州理塘县德达乡小毛亚坝村采集的药材质量较好，四川省阿坝州若尔盖日尔郎山2 号大桥采集的药材质量较差。

将24 批大花龙胆药材的马钱苷酸、獐牙菜苷、异红草苷、异金雀花素苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷、大花龙胆苷A 的含量原始数据导入SIMCA.14.1 统计分析软件中，进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图4。PCA 结果表明，不同批次大花龙胆分布较为分散，整体离散度较大，这可能与其产地不同有关，不同土壤及气候对药材中有效成分含量影响较大。尤其是，四川省甘孜州理塘县德达乡小毛亚坝村、四川省阿坝州若尔盖日尔郎山2 号大桥采集的药材与其余批次差异较明显。

图4 不同产地PCA 得分图Fig.4 Score plot of PCA of different producing areas

3 讨论

大花龙胆作为白花龙胆的主流药材，主要成分为大花龙胆苷A、马钱苷酸、獐牙菜苷、异荭草苷、异金雀花素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、异金雀花素、乌奴龙胆苷D、平龙胆酯苷[1-4]。其中，大花龙胆苷A和异荭草苷是大花龙胆中环烯醚萜类和黄酮类成分的主要活性成分，含量高且稳定性好，因此选择大花龙胆苷A 和异荭草苷为内标物，建立QAMS 法，弥补了对照品不足的缺点，实现藏药材多成分质量控制，也体现了一测多评法低成本的优势。

参考相关文献报道[14-18]，本研究采用2 个不同的高效液相色谱仪和4 种不同的色谱柱对相对校正因子进行考察，同时，对柱温和体积流量也进行了相对校正因子的耐用性考察，结果RSD 值都小于5.0%，说明QAMS 法的系统耐用性良好。

本研究共收集得到不同产地的药材24 批，根据QAMS 法和ESM 法进行含量测定与分析，结果表明2 种方法的结果基本一致，无显著差异。验证了QAMS 法的可行性与准确性。对24 批药材进行指纹图谱相似度评价、热图分析、PCA，发现不同产地药材具有较高的一致性，但质量差异显著。其中，四川省甘孜州理塘县德达乡小毛亚坝村地区药材质量最优。本试验建立的一测多评法适用于大花龙胆中8 种有效成分的含量测定，相对校正因子稳定；该法不仅节约检测成本、缩短检测时间，而且简化了大花龙胆的定量检测方法，具有很强的实用性，可为大花龙胆后续的质量评价提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突