远志HPLC 指纹图谱及rbcL 序列分子鉴定研究

郑玉霄，杨 晨，张 彬，李鹏辉，龚年春，李 超，李跃辉*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013

3.湖南省药品评审与不良反应监测中心，湖南 长沙 410013

远志为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志P.sibiricaL.的干燥根，其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，视为养命之要药，具有安神益智、祛痰消肿等功效，主要用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚等[1]。现代研究表明，远志中含皂苷、酮、寡糖酯等化学成分，具有改善认知障碍、增强学习记忆、抗衰老等药理作用[2-3]，临床应用广泛。

远志是我国常用大宗药材，但近年来随着临床需求量的增加，其野生资源大量减少。目前，我国的远志主要分布在山西、陕西、河北和山东等地，以山西和陕西为主要产地[4]。但由于生产周期长、产量低、规模小，市场上近缘种、习用品、掺伪现象较多。白薇、瓜子金、三叶香草等经常被用于充当远志药材，严重影响远志药材质量和用药安全[5]。目前对远志的鉴别以传统的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等为主，但传统鉴别对鉴定者理论基础和实践经验要求较高，并且受准确性、检测效率、药材形态等因素限制，影响药材鉴定准确性。近年来，DNA 分子鉴定、高效液相色谱等技术被逐渐应用到中药的质量控制[6]。本研究拟通过HPLC 指纹图谱对来自3 个产地的14 批远志药材进行指纹图谱研究，并通过DNA 分子鉴定技术对14 批远志药材及其近缘种白薇、瓜子金等进行rbcL 序列的鉴别研究，通过化学成分表征和分子生物学信息相结合，为远志药材的质量控制及质量评价提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

14 批远志药材从陕西、山西采集，保存于湖南省中医药研究院中药创新药物研究所，经刘浩副研究员鉴定14 批药材基原植物为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.。14 批远志药材产地信息见表1。市售白薇（编号202101，产地为山东）、瓜子金（编号202201，产地为江西）经刘浩副研究员鉴定其基原植物分别为萝藦科植物白薇Cynanchum atratumBge.和远志科植物瓜子金P.japonicaHoutt.。远志对照药材（批号120989-201107）购自中国食品药品检定研究院。远志酮III（批号100298-201203，中国食品药品检定研究院）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（批号100298-201203，中国食品药品检定研究院）、西伯利亚远志糖 A5（批号107702-201801，宝鸡市金台区盛世科技仪经营部），所有对照品质量分数均大于98%。

表1 14 批远志药材来源信息Table 1 Information of 14 batches of P.tenuifolia

1.2 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity II，安捷伦），XPE-105 型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），Quintix224-1CN 型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），GY-FS-06 型粉碎机（江西赣云食品机械有限公司），Multifuge×1R 型冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司），Eppendorf AG 22331 Hamburg 型聚合酶链式反应仪（德国艾本德股份公司），Universal Hood II 型凝胶成像仪（武汉佰蕾真生物科技有限公司），JY-SPCT 型电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱

2.1.1 色谱条件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，0.5 μm，SN：USCL041482），柱温30 ℃；检测波长316 nm；进样量10 μL；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B；按表2 进行梯度洗脱，预运行10 min，体积流量1.0 mL/min。

表2 流动相梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure of mobile phase

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取14 批远志药材样品粉末（过四号筛）各1.0 g，置50 mL 锥形瓶中，精密加入70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）10 mL，称定质量，超声（300 W、40 kHz）30 min，取出放冷，再称定质量，用70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）补足减失的质量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。精密称取远志对照药材粉末（过四号筛）1.0 g，同法制得远志对照药材溶液。

2.1.3 对照品溶液制备 取对照品西伯利亚远志糖A5、远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖适量，加甲醇溶解，制成各含西伯利亚远志糖A5、远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖约0.2 mg/mL 的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.1.4 精密度试验 取编号为202004 的远志药材样品，采用“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。标定20 个特征峰，以5 号峰3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果20 个共有峰的相对保留时间的RSD 不超过0.53%，相对峰面积的RSD不超过1.67%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取编号为202004 的远志药材样品，采用“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。标定20 个特征峰，以5 号峰为3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果20个共有峰的相对保留时间的RSD 不超过0.53%，相对峰面积的RSD 不超过1.45%，表明本方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取编号为202004 的远志药材样品，采用“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件，分别于0、2、6、9、22、26、33 h 进样，记录色谱图。标定20 个特征峰，以5 号峰为3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，20 个共有峰相对保留时间RSD 不超过0.66%，相对峰面积RSD 不超过1.68%，证明供试品溶液在33 h 内稳定性好。

2.1.7 指纹图谱的建立及相似度分析 精密称取14 批远志药材样品粉末（过四号筛）各1.0 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。通过与混合对照品溶液比对，指认了3 个成分，分别为西伯利亚远志糖A5（1 号峰）、远志酮III（3 号峰）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（5 号峰）。将测定获得的14 批远志药材HPLC 图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，进行多点校正（20 个Marker 峰）并自动匹配，以中位数法生成对照指纹图谱（R），时间窗宽度为0.1，选择S1为参照图谱，以5 号峰（3,6′-二芥子酰基蔗糖）为参照峰（S），标定了20 个特征峰。色谱图见图1。

图1 不同产地远志药材 (A)、对照指纹图谱 (B) 和混合对照品图谱 (C)Fig.1 P.tenuifolia from different producing areas (A),reference fingerprint (B) and chromatogram of mixed reference (C)

计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积，计算得到20 个共有峰相对保留时间的RSD 在1.05%以内，相对峰面积的RSD 在18.97%以内，说明不同产地远志药材内含物有一定差异。计算各样品指纹图谱与对照药材及对照指纹图谱（R）的相似度。结果如表3 所示，以对照药材计算相似度，14 批远志药材相似度为0.918～0.945，RSD为0.989 8%；以对照指纹图谱计算相似度为0.997～0.999，RSD 为0.064 7%。

表3 远志药材相似度评价结果Table 3 Similarity evaluation results of P.tenuifolia

2.1.8 聚类分析 将14 批远志样品20 个共有峰的峰面积数据导入SPSS 25.0 软件进行分析，选择组间连接和平方欧式距离的方法，作聚类分析树状图。由图2 可知，当欧式距离为15 时，14 批远志按产地分为3 类，可见不同产地远志化学成分的含量存在一定的差异。

图2 14 批远志HPLC 指纹图谱聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 14 batches of P.tenuifolia

2.1.9 主成分分析（principal component analysis，PCA） 将14 批远志指纹图谱的20 个共有峰的峰面积导入SIMCA 17 软件，建立PCA 模型，得到模型解释率参数R2X＝0.850，预测能力参数Q2＝0.529，表明提取的主成分可解释85.0%的原始变量，模型的预测能力为52.9%。不同产地远志的PCA 得分图见图3，可见14 批远志样品基本分为3 类，与聚类分析结果相互佐证，进一步说明不同产地远志药材化学成分的含量存在一定的差异。

图3 不同产地远志PCA 得分图Fig.3 PCA score diagram of P.tenuifolia from different producing areas

2.1.10 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 为进一步寻找导致不同产地远志药材间差异的标志物，采用OPLS-DA 模型对14 批远志药材样品进行分析。将14 批远志指纹图谱的20 个共有峰的峰面积导入SIMCA 17 软件，建立OPLS-DA 模型，模型解释率参数R2X和R2Y分别为0.846 和0.953，模型预测能力参数Q2为0.881，表明模型对变量X的可解释能力为84.6%，对变量Y的可解释能力为95.3%，模型的预测能力为88.1%，说明该模型稳定、可靠。OPLS-DA模型结果见图4，该结果与聚类分析、PCA 结果一致，进一步验证了分析结果的可靠性。

图4 不同产地远志OPLS-DA 得分图Fig.4 OPLS-DA score diagram of P.tenuifolia from different producing areas

采用统计推断方法分析该模型[7]，对模型进行200 次置换检验进行验证，结果如图5 所示，检验参数R2＝（0，0.324）、Q2＝（0，−0.605），所有位于左边的R2和Q2值均低于最右边的值，且Q2点的回归线与垂直轴（左侧）相交于0 以下，表明所建立的模型未出现过拟合现象，可用于14 批远志药材的判别分析。变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值是筛选差异性化合物的重要指标，VIP 值越高，说明其对组间差异的影响越大[8]。提取20 个共有峰VIP 值，以VIP＞1为标准[9-10]，筛选出10 个主要峰，见图6，按VIP值大小排序分别为1（西伯利亚远志糖A5）、15、5（3,6′-二芥子酰基蔗糖）、14、4、19、18、3（远志酮III）、17、13 号峰。由此可见，这10 个峰对应的化学成分可能是导致3 个不同产地远志药材产生差异的主要原因。

图5 OPLS-DA 模型置换检验图Fig.5 OPLS-DA model replacement test diagram

图6 不同产地远志OPLS-DA 的VIP 值图Fig.6 VIP value diagram of P.Tenuifolia from different producing areas

2.2 rbcL 序列分子鉴定

2.2.1 样品DNA 提取 药材用75%乙醇擦拭药材表面，自然晾干，刮去外皮，液氮速冻研磨使成粉末，照高效植物基因组DNA 提取试剂盒说明书操作，提取样品基因组DNA。

2.2.2 PCR 扩增 PCR 反应体系25 μL：2×Prime STAR Max Premix 12.5 μL，引物：rbcLa_F：5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’；rbcLa_R：5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’各0.75 μL，DNA 模板1 μL，灭菌水补足至25 μL。扩增程序：95 ℃、4 min；94 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、10 min。制备1%琼脂糖凝胶，电泳检测PCR 产物2 μL 结果见图7，可见各样品扩增条带单一明亮，表明各样品均扩增成功。

图7 rbcL 序列PCR 产物电泳图Fig.7 Electrophoretogram of PCR products of rbcL sequence

2.2.3 rbcL 测序分析 rbcL 序列测序由长沙擎科生物科技公司测序完成。测序结果通过Seqman 软件进行序列拼接和人工校正，去除拼接后的序列两端的低质量区。将所得序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行Blast 对比鉴别，取相似性最高的比对结果。比对结果显示，14 批远志（编号202001～202014）的rbcL 序列一致，与NCBI 数据库中物种PolygalatenuifoliaWilld（登录号：OK217278.1、NC_050829.1）的相似性均达到100%。白薇（编号202101）与物种CynanchumatratumBge.（登录号：GQ436511.1）的相似性达100%。瓜子金（编号202201）与物种PolygalajaponicaHoutt.（登录号：MN206278.1）的相似性达100%。

另从GenBank 数据库下载了远志混淆品的rbcL序列共7 条，样品信息见表4，采用MEGA-X 软件计算遗传距离，并构建系统发育树。遗传距离结果见表5，远志种内的遗传距离均为0.000，远志与混淆品的遗传距离为0.006 4～0.741 7。采用NJ 法构建了系统发育树，结果见图8，远志属共聚为一个大支，其中14 批远志样品与NCBI 数据库中远志已有序列聚为一支，混淆品各自分支或相互聚为一支。

图8 基于rbcL 序列构建的NJ 树Fig.8 NJ tree based on rbcL sequences

表4 样品信息Table 4 Sample information

表5 遗传距离分析Table 5 Genetic distance analysis

3 讨论

3.1 提取工艺的优化

本研究对回流提取与超声提取2 种方式进行了考察，结果发现回流提取与超声提取所得的远志药材图谱无差异，考虑到操作的方便性，选择超声提取作为处理方式。对提取溶剂甲醇、水、70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）进行考察，发现70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）样与水样的检测图谱中整体峰形较好、分离效果较好，峰数多，但水样在制备时难滤过，滤液较浑浊，因此选择70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）作为提取溶剂。对提取溶剂70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）不同用量10、20、30 mL 进行考察，发现溶剂用量对远志药材HPLC图谱的峰数、分离效果无明显影响，考虑到溶剂用量高时，响应值较低，不利于峰信号采集，故选择10 mL 作为溶剂用量。对提取时间进行考察，发现提取时间20、30、40、50 min 对远志药材HPLC 图谱的峰数、分离效果无明显影响，为保证样品提取完全，选择30 min 作为提取时间。

3.2 色谱条件的优化

本研究对不同流动相（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液）进行了考察，发现当流动相为乙腈-水时后四分之一时间段内的色谱峰基线不平稳，色谱峰分离效果差。乙腈-0.05%磷酸和乙腈-0.1%磷酸2 种流动相体系的色谱峰相似，故选择乙腈-0.05%磷酸作为流动相。对检测波长（210、254、316、350 nm）进行了考察，结果发现检测波长为254 nm 和350 nm 时，后三分之一时间段没有色谱峰。210 nm 和316 nm 波长下的色谱图相似，但210 nm 为紫外末端吸收，背景基线高，流动相在该波长下吸收也很明显；316 nm 波长下色谱峰的分离效果更好，故选择316 nm 作为检测波长。

3.3 指纹图谱及化学计量学结果分析

为进一步对不同产地远志药材进行质量评价，本研究在最佳色谱条件下对14 批不同产地远志药材进行指纹图谱分析，14 批远志样品以对照药材图谱和对照指纹图谱计算相似度分别为0.918～0.945和0.997～0.999，RSD 分别为0.989 8%和0.064 7%，可以看出，以生成的对照指纹图谱计算相似度结果更好，说明14 批远志药材相似度高，但是与对照药材存在一定差异。指纹图谱标定了20 个共有峰，指认了3 个共有峰化学成分。聚类分析结果为当欧氏距离为15 时可将14 批远志药材按产地聚为3 类，此结果与PCA、OPLS-DA 的结果一致，同时通过OPLS-DA 的VIP 筛选法得到VIP 大于1 的10 个峰，推测这10个峰对应的化学成分可能是导致3个不同产地远志样品产生质量差异的潜在成分，可对不同产地远志药材的质量控制中指标成分的选择提供参考。运用化学模式对远志药材质量进行综合分析，方法简便、准确、重复性好，可为远志药材全面质量评价提供更完善的方法。

3.4 rbcL 序列分子鉴定结果分析

在植物药4 种DNA 条形码通用引物序列中，ITS2 序列与psbA-trnH 序列用于远志的DNA 分子鉴定已有报道[5,11]，目前尚未见文献对远志matK 序列和rbcL 序列分子鉴定相关研究。本研究对远志样品matK 序列和rbcL 序列进行了PCR 扩增，两种序列PCR 扩增条带明亮，但后续测序结果发现远志样品matK 序列的测序结果多为双峰，会影响分析结果的准确性，因此最终选择rbcL 序列进行后续的研究。本研究成功扩增并测定了14 批远志药材rbcL序列，经与NCBI 数据库比对，远志各批次样品的rbcL 序列与公共数据库中远志科植物远志的基因组序列相似性均达到100%，验证了14 批远志基原均为远志科植物远志。通过遗传距离分析，发现14批远志药材种内遗传距离均为0，说明14 批远志药材均为同一物种。结合遗传距离和NJ 树分析，发现rbcL 序列能将远志及其混淆品明显区分开来。因此，rbcL 序列可以对远志及其混淆品白薇、瓜子金、西南远志等进行有效鉴定，为该药材的区分鉴定提供了新的技术手段，丰富了NCBI 远志序列库。

DNA 分子鉴定是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA 片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，具有快速、便捷、通用、对技术人员要求低等优点，是对传统鉴定方法的有效补充，近年来该技术被广泛应用于中药材及其基原植物的鉴定[12-14]。HPLC 指纹图谱是基于对物质群整体作用的认识，借助于色谱技术获得的中药化学成分的色谱图，是实现鉴别产品真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可靠手段[15-16]。2 种鉴别方法分别从分子水平和化学成分水平鉴别，一个侧重微观层面，另一个侧重宏观层面，能更全面地评价药材质量。本研究所建立的指纹图谱方法专属性强，rbcL 序列分子鉴定方法准确度高，稳定性好，为有效控制远志药材的质量和远志药材的区分鉴定提供了依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突