海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞增殖的作用研究

任彧娜，刘晓庆，曹 灿，李慕云，廖文勇，张淑静，于 雪，范盎然，修琳琳，钟赣生

北京中医药大学，北京 100029

海藻与甘草属于“十八反”禁忌，历代关于其能否同服的争议颇多[1]。临床中海藻-甘草配伍组合常用于治疗甲状腺疾病，如明代王肯堂《证治准绳》中记载的昆布散可治疗瘿瘤，明代陈实功《外科正宗》中首载的海藻玉壶汤常用于治疗瘰疬、瘿瘤，清代顾世澄《疡医大全》中的消痰汤可用于治疗瘰疬、癥瘕，以上组方均含海藻-甘草配伍且能取得良好疗效[2-3]。关于海藻-甘草反药组合有大量实验研究，其可行性及科学性目前正在被现代科学逐步验证和阐释[4-5]。甲状腺肿大是一种常见的内分泌系统疾病，中医学称甲状腺肿大为“瘿病”，情志郁结、饮食不节、地域差异及体质因素等均可导致脏腑经络失和，气、痰、血壅结形成瘿[6-8]。西医学则认为引起甲状腺功能异常的有诸多因素，如碘摄入不足或摄入过量、自身免疫系统紊乱等，导致甲状腺上皮细胞增生，从而形成甲状腺肿大[9]。在甲状腺肿大的形成过程中，伴随着甲状腺组织的增生和细胞的增殖，细胞凋亡与增殖失衡，凋亡相对不足[10]。

近年来，关于海藻与甘草配伍作用机制的研究较多，但多为包含海藻、甘草的全方，较少直接探讨海藻-甘草对甲状腺肿大的作用[11]。本研究以人甲状腺正常细胞Nthy-ori-3-1 为研究对象，选取前期实验效果最佳剂量即《中国药典》2020 年版高限剂量的2 倍（海藻24 g、甘草20 g）制备含药血清[12-13]，通过观察海藻-甘草含药血清对Nthy-ori-3-1 细胞增殖模型的影响，探讨其抗甲状腺肿大的可能作用机制，为海藻-甘草作为可靠的临床用药提供依据。

1 材料

1.1 动物与细胞

SPF 级雄性Wistar 大鼠30 只，10 周龄，体质量300～340 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号SCXK（京）2021-0011，使用许可证号SYXK（京）2020-0033。动物饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，室内温度（22±2）℃，相对湿度60%～70%。动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号BUCM-4-2021072001-3037）。

Nthy-ori-3-1 细胞购自商城北纳创联生物科技有限公司，细胞编号340487。

1.2 药品与试剂

海藻配方颗粒（批号21061391）、甘草配方颗粒（批号21070231）购自江阴天江药业有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批号2350404RP）、青链霉素混合液（批号187689）购自美国Invitrogen公司；含EDTA 的胰酶（批号2323143）购自美国Gibco 公司；CCK-8 试剂（批号AQ308-500T）、RPMI 1640 培养基（批号10752109088）购自北京翱擎生物科技有限公司；促甲状腺激素受体人单克隆抗体M22（批号m22-11ar）购自英国RSR 公司；电镜固定液（批号CR2305008）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批号CR2209008）、DAPI 染色试剂（批号CR2302026）、CY3 标记山羊抗兔IgG 抗体（批号CR2203118）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；812 包埋剂（批号CR2304084）购自美国SPI 公司；细胞周期检测试剂盒（批号20220822）、BCA 蛋白含量检测试剂盒（批号20200720）购自凯基生物技术股份有限公司；细胞凋亡检测试剂盒（批号20010370）、β-actin 小鼠单克隆抗体（批号10025459）、微管相关蛋白轻链3（microtubuleassociated protein light chain3，LC3）多克隆抗体（批号00115896）、Beclin1 多克隆抗体（批号00106238）购自美国Proteintech 公司。

1.3 仪器

Heracell Vios 160i 型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；OptiMair 型超净工作台（新加坡ESCO 公司）；5702R 型台式低温离心机（德国Eppendorf 公司）；CPOCH 型全波长酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；Echo Revolve 型正倒置一体荧光显微镜（美国Echo 公司）；HT7800 型透射电子显微镜（日本Hitachi 公司）；FACSCelesta 三激光流式细胞仪（美国BD 公司）；GS-900™ Calibrated Densitometry System 型凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 海藻-甘草含药血清的制备

30 只SPF 级雄性Wistar 大鼠适应性喂养3 d后，随机分为对照组和海藻-甘草组。按前期实验基础选择海藻、甘草生药剂量为《中国药典》2020 年版高限剂量的2 倍（海藻24 g、甘草20 g）[12-13]，即7.92 g/kg，将海藻和甘草配方颗粒用去离子水混匀配制成混悬液，每日ig 2 次。对照组ig 等体积去离子水，2 次/d，连续5 d。于末次给药1 h 后麻醉，腹主动脉取血，于4 ℃冰箱中静置2 h，待其自然凝血，取上清液，2 500 r/min 离心15 min，取血清，于56 ℃水浴30 min 灭活，用0.22 μm 微孔滤器滤过除菌，分装于15 mL 离心管中，保存于−80 ℃冰箱备用。

2.2 细胞培养

Nthy-ori-3-1 细胞用含 10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基，常规培养于37 ℃、5% CO2的培养箱，饱和湿度，严格无菌，每2～3 天用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.3 CCK-8 法检测Nthy-ori-3-1 细胞增殖

2.3.1 M22 对Nthy-ori-3-1 细胞增殖的影响 取对数生长期的Nthy-ori-3-1 细胞，以1×105个/mL 接种于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 μg/mL）的M22，对照组加入等体积PBS，每组设3 个复孔。在37 ℃、5% CO2条件下，分别作用细胞12、24、48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养1 h，用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A）值。

2.3.2 海藻-甘草含药血清对Nthy-ori-3-1 细胞活性影响 取对数生长期的Nthy-ori-3-1 细胞，以1×105个/mL 接种于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，设置对照组、模型组和海藻-甘草含药血清组，模型组给予0.125 μg/mL M22 培养24 h，对照组给予等体积PBS；海藻-甘草含药血清组在模型建立的基础上，分别加入5%、10%、15%、20%海藻-甘草含药血清，每组设3 个复孔。37 ℃、5% CO2条件下，作用细胞24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养1 h，用酶标仪测定450 nm 处的A值。

2.4 倒置相差显微镜观察Nthy-ori-3-1 细胞形态

取对数生长期的Nthy-ori-3-1 细胞，以2×105个/mL 接种于6 孔板，每孔2 mL，待细胞贴壁后，设置对照组、模型组和海藻-甘草含药血清组，模型组给予0.125 μg/mL M22 培养24 h，对照组给予等体积PBS，海藻-甘草组在模型建立的基础上，加入15%海藻-甘草含药血清，每组设3 个复孔。37 ℃、5% CO2条件下，作用细胞24 h 后，倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化。

2.5 透射电镜观察Nthy-ori-3-1 细胞形态

细胞接种、分组及药物处理方法同“2.4”项，药物作用Nthy-ori-3-1 细胞24 h 后，离心收集细胞，加入电镜固定液于4 ℃固定4 h，加入1%锇酸固定2 h，依次乙醇、丙酮脱水，渗透包埋，将树脂块于超薄切片机超薄切片60～80 nm，经醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色8 min 和避二氧化碳染色8 min，室温干燥过夜。于透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

2.6 流式细胞术检测Nthy-ori-3-1 细胞周期分布

细胞接种、分组及药物处理方法同“2.4”项，每组设3 个复孔。37 ℃、5% CO2条件下，药物作用Nthy-ori-3-1 细胞24 h 后，制备细胞密度为1×106个/mL 细胞悬液，加入70%冷乙醇固定，按Rnase A-PI（1∶9）配制染色工作液，避光染色60 min 后200 目筛网滤过，于流式细胞仪记录激发波长488 nm 处红色荧光。

2.7 流式细胞术检测Nthy-ori-3-1 细胞凋亡

细胞接种、分组及药物处理方法同“2.4”项，每组设3 个复孔。37 ℃、5% CO2条件下，药物作用Nthy-ori-3-1 细胞24 h 后，制备细胞密度为1×106个/mL 细胞悬液，加入CL488-Annexin V 和PI工作液，避光，4 ℃染色15 min 后200 目筛网滤过，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.8 免疫荧光检测LC3 平均荧光强度

细胞接种、分组及药物处理方法同“2.4”项，每组设3 个复孔，药物作用24 h 后，将爬片甩干，用组化笔在盖玻片细胞均匀分布处画圈。在圈内加100 μL 破膜工作液，室温孵育20 min，再滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育50 min，滴加DAPI 染液后，用抗荧光淬灭封片剂封片，进行图像采集。

2.9 Western blotting 检测Beclin1 蛋白表达

细胞接种、分组及药物处理方法同“2.4”项，每组设3 个复孔。37 ℃、5% CO2条件下，药物作用Nthy-ori-3-1 细胞24 h 后，弃去培养基，加入RIPA裂解液，于冰上裂解细胞30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清，以BCA 试剂盒测定蛋白质量浓度。加入适量Loading buffer，使用PCR 仪在95 ℃、12 min 条件下使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h，加入ECL 显色液，显影并定影。以β-actin 为内参，采用Image J 软件分析各条带灰度值。

2.10 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示。若数据方差齐，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用最小显著性差异法（LSD）；若方差不齐，采用Dunnett’s 检验。

3 结果

3.1 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞增殖的影响

如图1 所示，与对照组比较，0.062 5、0.125 0、0.250 0 μg/mL 的M22 作用24 h，能够显著促进细胞增殖（P＜0.05、0.01），其中以0.125 0 μg/mL 的M22 促增殖作用最为明显。

图1 M22 对Nthy-ori-3-1 细胞增殖的影响 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of M22 on proliferation of Nthy-ori-3-1 cells(±s, n = 3)

经0.125 μg/mL 的M22 处理Nthy-ori-3-1 细胞24 h，再分别给予5%、10%、15%、20%海藻-甘草含药血清干预24 h，如图2 所示，与对照组比较，模型组细胞活力显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组细胞活力均显著降低（P＜0.05、0.01），以15%海藻-甘草含药血清效果最佳。

图2 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞增殖的影响 (±s, n = 3)Fig.2 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on proliferation of M22-induced Nthy-ori-3-1 cells (±s, n = 3)

3.2 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞形态的影响

如图3 所示，对照组细胞为梭形或不规则形，呈贴壁生长；模型组细胞数量增多，形态饱满，出现过度增殖现象；海藻-甘草含药血清干预后，细胞增殖被抑制，凋亡细胞增加，细胞密度减少。

图3 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞形态的影响 (×100)Fig.3 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on morphology of M22-induced Nthy-ori-3-1 cells (× 100)

3.3 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞超微结构的影响

如图4 所示，对照组细胞形态正常，边界清晰；模型组细胞内质网发达扩张，线粒体肿胀，溶酶体较少；海藻-甘草含药血清干预后，自噬小体增多，细胞肿胀减轻。

图4 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞超微结构的影响Fig.4 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on ultrastructure of M22-induced Nthyori-3-1 cells

3.4 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞周期分布的影响

如图5 所示，与对照组比较，模型组G0/G1期细胞比例明显下降（P＜0.01），S 期和G2/M 期细胞比例无明显差异；与模型组比较，海藻-甘草含药血清组G0/G1期细胞比例明显升高（P＜0.01），S 期和G2/M 期细胞比例无明显差异。

图5 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞周期分布的影响 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on cell cycle distribution of M22-induced Nthyori-3-1 cells (±s , n = 3)

3.5 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞凋亡的影响

如图6 所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，海藻-甘草含药血清组细胞凋亡率显著上升（P＜0.01）。

图6 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞凋亡的影响 (±s , n = 3)Fig.6 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on apoptosis of M22-induced Nthy-ori-3-1 cells(±s , n = 3)

3.6 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞LC3 表达的影响

如图7 所示，与对照组比较，模型组LC3 平均荧光强度降低；与模型组比较，海藻-甘草含药血清组LC3 平均荧光强度增加。

3.7 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1细胞Beclin1 蛋白表达的影响

如图8 所示，与对照组比较，模型组自噬关键蛋白Beclin1 表达显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，海藻-甘草含药血清组Beclin1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。

图8 海藻-甘草含药血清对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞Beclin1 蛋白表达的影响 (±s , n = 3)Fig.8 Effect of Sargassum-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma containing serum on Beclin1 protein expression of M22-induced Nthy-ori-3-1 cells (±s, n = 3)

4 讨论

甲状腺肿大是一种常见的内分泌系统疾病，常伴有甲状腺组织增生和细胞异常增殖，临床上常见于单纯性甲状腺肿大、甲状腺功能亢进或减退、甲状腺结节和甲状腺腺瘤等[10,14]。古今治疗甲状腺肿大的方药中多包含有海藻和甘草的配伍组合，二者虽为反药，却在治疗甲状腺疾病中取得了良好的疗效[15-17]。课题组前期研究表明，包含海藻-甘草配伍的海藻玉壶汤对甲状腺肿大模型大鼠的甲状腺功能、甲状腺系数及甲状腺相关基因的表达均有明显的纠正作用，且全方组效果明显优于各拆方组，海藻、甘草二者缺一不可[18-20]。

M22 现已广泛应用于建立毒性弥漫性甲状腺肿大（Graves disease，GD）和Graves 眼病的细胞模型[21]。GD 患者由于体内的促甲状腺激素受体抗体（thyrotropin receptor antibody，TRAb）分泌过多，导致了甲状腺肿大、甲状腺功能亢进等症状。M22是来自于人体的TSAb 单克隆抗体，TSAb 是TRAb的一种，TRAb 的功能与促甲状腺激素（thyroidstimulating hormone，TSH）类似，因而M22 可以模拟TRAb 的作用，与促甲状腺激素受体（thyroidstimulating hormone receptor，TSHR）竞争性结合进行信号转导，从而引起甲状腺滤泡细胞的过度增殖，分泌过多的甲状腺激素[22-24]。本研究采用M22 刺激Nthy-ori-3-1 细胞建立体外过度增殖模型，通过CCK-8 法检测发现，M22 能明显促进Nthy-ori-3-1细胞增殖，并且0.125 μg/mL 的M22 在作用24 h 时促进细胞增殖的效果最佳。

经M22 刺激的Nthy-ori-3-1 细胞给予海藻-甘草含药血清后，呈现出典型的凋亡特征性改变，细胞数量减少，细胞生长增殖被抑制。流式细胞术结果显示，海藻-甘草含药血清能使Nthy-ori-3-1 细胞的凋亡率明显升高。细胞周期有2 个重要节点，G0/G1期向S 期的转换以及S 期向G2/M 期的转换，S 期是DNA 合成的重要时期。M22 可使G0/G1期细胞比例明显减少，S 期比例略有增加但无明显差异，提示细胞合成增加，细胞增殖被促进；经海藻-甘草含药血清作用后，G0/G1期细胞比例增加，而S 期和G2/M 期无明显差异，推测海藻-甘草含药血清可能主要在G0/G1期发挥作用，从而抑制Nthy-ori-3-1细胞的增殖。

本研究发现，海藻-甘草含药血清可能通过诱导自噬发生来促进Nthy-ori-3-1 细胞的凋亡。LC3 和Beclin1 是自噬形成过程的核心因子，其表达水平变化常用来监测自噬的发生及形成[25-26]。本研究测定Nthy-ori-3-1 细胞的LC3 和Beclin1 蛋白表达水平，结果显示与对照组比较，模型组LC3 平均荧光强度降低，Beclin1 蛋白表达下调，这提示了在M22 刺激Nthy-ori-3-1 细胞增殖的过程中，伴有自噬功能的失调；而与模型组比较，海藻-甘草含药血清组LC3 平均荧光强度明显升高，Beclin1 蛋白表达明显上调，提示海藻-甘草含药血清可能通过促进自噬的发生，从而促进细胞凋亡，发挥抗甲状腺肿大的作用。

本研究初探海藻-甘草对M22 诱导的Nthy-ori-3-1 细胞增殖模型的影响，发现海藻-甘草含药血清可以明显抑制Nthy-ori-3-1 细胞增殖，促进其凋亡。同时，海藻-甘草含药血清可促进LC3 与Beclin1 蛋白表达，后续可研究自噬相关通路其他信号分子的表达情况，进一步探索海藻-甘草配伍对自噬功能的影响。自噬与增殖关系复杂，诱导自噬可能促进增殖，也有可能抑制增殖。本研究观察到海藻-甘草含药血清对自噬的抑制作用，进一步探讨其对细胞增殖的影响，可能为甲状腺疾病防治带来新的突破。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突