一种长时稳定的铅离子响应型脱氧核酶的合成与表征

陈 词，蒯海岚，李林羚，胡 霞，杨基峰，张松柏

（湖南文理学院，化学与材料工程学院，水处理功能材料湖南省重点实验室，电镀废水回用技术湖南省工程研究中心 湖南 常德 415000）

脱氧核酶是一类具有酶活性的核酸分子，1994 年首例铅离子响应的脱氧核酶被报道［1］，随后显现出其在生物化学领域的应用研究潜力［2］，引起了研究者的广泛关注。经历了近三十年的发展，目前脱氧核酶相关领域取得了较多的研究成果：一方面，脱氧核酶被广泛应用于生物传感领域［3］，实现了对金属离子、核酸、蛋白质以及细菌等多种靶标的有效检测［4］，例如Ye 等［5］利用金纳米颗粒与脱氧核酶构建了表面等离子体共振-散射（SPR- S）的分析平台用于检测铅离子，其检出限达10 fmol/L；另一方面，随着脱氧核酶类型的不断丰富，其介导的化学反应不再局限于核酸底物，催化卟啉金属化以及Diels-Alder环加成的脱氧核糖也有报道［6-7］。由此可见，脱氧核酶具有较强的应用研究潜力，其在应用研究中所面临的问题值得进一步关注。

核酸分子易被各类核酸酶降解一直是功能核酸在生命健康相关研究领域应用时所面临的问题［8］，脱氧核酶作为一种功能核酸也不例外［4］。目前被报道较多且较为成熟的改进策略是对脱氧核酶的核酸结构进行化学修饰，如甲氧基、倒T碱基修饰等［9-10］，这类策略在提升核酸分子耐酶切能力方面表现较好，且核酸分子结构上存在较多可修饰位点［11］。但在基础研究层面，化学修饰带来的毒性及其对功能核酸结构的影响仍不容小觑［12］，大部分化学修饰操作繁琐且价格高昂，这也相应地增加了研究成本。因此，进一步优化化学修饰相关改进策略或者寻找新的改进策略仍受关注。本研究从寻找新的改进策略角度出发，结合课题组在环形功能核酸领域的相关研究成果，选取较为成熟的铅离子响应脱氧核酶为研究对象，以GR-5 序列为研究模型［13］，通过对其改造设计合成了环形GR-5 脱氧核酶（命名为CirnGR-5），并进一步探讨了核酸环化策略对脱氧核酶催化活性与稳定性的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津UV2600紫外可见分光光度计，美国Bio-Rad 凝胶电泳仪，上海天能Tanon 5200化学发光成像系统，日立F-7000 荧光分光光度计，雷磁PHS-3C PH 计，杭州佑宁G100 干式恒温器，赛洛捷克MXS漩涡混合器，默克密理博MilliQ纯水仪。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，98%）、无水柠檬酸（99.5%）、乙酸镁（98%）均购于安徽泽升科技有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）均购于国药集团化学试剂有限公司，硝酸钾（分析纯）购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司，TMB（98%）购于萨恩化学技术（上海）有限公司；3%过氧化氢、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；Hemin（98%）、乙酸钠（99%）购于上海麦克林生化科技股份有限公司；核酸染料Gelstainred购于苏州优逸兰迪生物科技有限公司，四甲基乙二胺（TEMED，>99%）购于长沙鼎国生物技术有限公司，30% 聚丙烯酰胺-甲叉双丙混合液购于Biosharp 公司，无水乙酸铅（99%）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，Tris（>99.9%）、6X 聚蔗糖凝胶上样缓冲液 III（含二甲苯青、溴酚蓝、Tris-HCl、EDTA）购于生工生物工程（上海）股份有限公司，胎牛血清（FBS）购于美国Zeta life公司。

蛋白酶类相关试剂：T4 DNA连接酶（T4连接酶）及其工作缓冲液、核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）及其工作缓冲液、核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）及其工作缓冲液均购于宝日医生物技术（北京）有限公司（Takara Bio）。

核酸类试剂：委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成与纯化，且所购买的序列在使用前均通过紫外分光光度计进行浓度的再测定。实验所用核酸序列如表1所示。

表1 实验所用核酸序列名称及其组成Table 1 The name and composition of the nucleic acid sequence used in the experiment

1.2 缓冲液的组成

①缓冲液A：10 mmol/L HEPES、50 mmol/L 乙酸钠、5 mmol/L 乙酸镁，pH 7.4；②缓冲液B：10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L乙酸钠、5 mmol/L 乙酸镁，pH 7.4；③缓冲液C：10 mmol/L磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、50 mmol/L 乙酸钠、5 mmol/L 乙酸镁，pH 7.4；④3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）显色液：每1.1 mL TMB 工作缓冲液加入5 µL 3% 过氧化氢、16.5 µL 10 mg/mL TMB 溶液（DMSO 溶解）。其中TMB 工作缓冲液的组成为：50 mmol/L 磷酸二氢钠、25 mmol/L 柠檬酸、20 mmol/L 硝酸钾；TMB 溶液（溶剂：DMSO）组成为：10 mg/mL TMB；显色时所用Hemin（血红素）溶液：使用DMSO 配制100 mmol/L 的高浓度Hemin 溶液，使用时用水稀释至实验所需浓度，且现配现用。⑤其他类型缓冲液：不同HEPES 缓冲液中仅HEPES 浓度（10、20、50 mmol/L）不同，其他盐离子加入量与缓冲液A 保持一致，其名称分别为A1、A2、A3；不同pH（7.4、6.4、5.4）的50 mmol/L HEPES 缓冲液中其他盐离子成分加入量与缓冲液A3保持一致，其名称分别为A3-7.4、A3-6.4、A3-5.4。

1.3 环形GR-5脱氧核酶的合成与表征

未成环的nGR-5脱氧核酶核酸序列（待成环序列，如bf-Cir-nGR-5）以及能与之杂交并促进成环的序列Cir-as（辅助杂交序列）以一定的物质的量之比（一般为1∶1，其中Cir-as 序列过量以保证杂交完全，本文使用比例为1∶4）稀释至1×T4 连接酶缓冲液中，均匀混合后于95oC 保持5 min，随后迅速转移至冰浴并保持30 min，结束后加入适量T4 连接酶于4oC 保存过夜。酶连接操作步骤结束后，混合液再于80oC保持15 min进行酶失活处理（实验时间与温度可根据酶用量进行提升），随后使用外切酶进行酶切以去除非成环序列，处理结束后的序列可用于进一步表征与使用。本研究的质谱表征委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。由于合成的环形序列的吸光度值无法确定，其合成后的浓度仍等同于合成前的浓度，故后续对实验结果进行分析时，需考虑浓度差带来的影响。

1.4 核酸分子的外切酶酶切实验

待酶切序列于1×Exo I缓冲液中稀释至合适浓度，加入定量或过量的Exo Ⅰ与Exo Ⅲ，再将混合溶液放置37oC进行酶切，酶切操作结束后再将混合溶液转入80oC保持15 min以完成酶失活处理（实验时间与温度可根据酶用量进行提升），所得溶液可用于下一步表征与使用。

1.5 脱氧核酶的酶切实验

将脱氧核酶序列与酶切底物序列以特定浓度比例稀释至缓冲液C 中并于95oC 保持5 min，随后迅速转移至冰浴并保持30 min，结束后加入特定浓度的铅离子，在室温条件下进行酶切。反应结束后的混合溶液于4oC保存并用于后续表征。

1.6 核酸分子的凝胶电泳表征

通过聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳对核酸分子进行表征，用于电泳的凝胶浓度有8%和12%两种，电泳缓冲液为1×TBE，电泳电压为110 V，电泳结束后使用Gelstainred 进行染色并于Tanon 5200化学发光成像系统进行成像。

1.7 荧光特性的表征

使用日立F-7000 对核酸序列的荧光特性进行表征，激发波长为488 nm（狭缝5.0 nm），发射波段为500~580 nm（狭缝2.5 nm），PMT电压为700 V，扫描速率为240 nm/min。

1.8 基于G-四联体/血红素复合物的表征

待表征的核酸序列在指定缓冲液中稀释至特定浓度，加入定量或过量的Hemin分子（本文使用的核酸与Hemin比例为1∶5），混合后于室温保持10 min，随后取10 µL混合液加入冰浴保存的TMB显色液190 µL，充分混合后置于室温避光显色，通过肉眼观察显色情况。此外，显色结果也可用紫外分光光度计进行测定。测定多个样品时，为保证测定条件的一致性，需对样本进行定时定点测定，且显色液需置于冰浴保存与取用，扫描波长范围为200~800 nm。

1.9 脱氧核酶的稳定性表征

不同组成的脱氧核酶序列在指定溶液（含外切酶的缓冲液、自来水以及75%胎牛血清）中稀释至2µmol/L，并分装成10~30 µL 的小管，在特定时间段取出后于95oC 变性5 min，并置于-20oC 保存，所有样本处理完毕后即可进行凝胶电泳表征。

2 结果与讨论

2.1 Cir-nGR-5脱氧核酶的合成与表征

为更好地研究结构环化对脱氧核酶活性的影响，同时避免序列环化引起的构型变化造成nGR-5脱氧核酶活性完全丧失，本文采取在nGR-5序列的末端引入与酶切底物序列碱基个数相近的碱基数目实现对环化前序列bf-Cir-nGR-5的设计，其序列组成如图1A所示。环形nGR-5脱氧核酶（Cir-nGR-5）则通过基于T4 连接酶的bf-Cir-nGR-5 环化方式合成，其成环方法流程如图1B 所示，并进一步通过凝胶电泳实验和质谱实验对合成结果进行表征。如图1C 所示为Cir-nGR-5 脱氧核酶合成凝胶电泳表征实验，通过对比Lane 4 与Lane 6 的条带存在情况，可初步确认有目标环形条带合成（图1C 箭头指向处）。进一步对Lane1和Lane 6的样本进行质谱表征（如图1D 所示），两个样本的测定结果差值接近一个水分子的相对分子质量，结合测定方法的误差允许范围，可确定Cir-nGR-5已被成功合成。

图1 Cir-nGR-5的合成方法与表征Fig.1 The synthetic process and result characterization of Cir-nGR-5

2.2 nGR-5脱氧核酶系列序列酶活性的表征

为进一步探究序列环化对脱氧核酶活性的影响，本文从nGR-5脱氧核酶系列序列酶有无活性以及酶活性表现两个角度进行探究，使用的酶切底物为nGR-5s（其组成见图1A）、nGR-5whgs，并结合凝胶电泳实验以及紫外、荧光以及比色等分析实验手段进行结果表征。

2.2.1nGR-5脱氧核酶系列序列酶活性的表征nGR-5脱氧核酶系列序列酶活性情况可通过nGR-5s底物序列的酶切实验进行表征，其酶切流程如图2A所示，酶切结果使用凝胶电泳实验进行表征。为保证底物序列与酶链充分结合，nGR-5、bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 三条序列分别以1∶2 的浓度比与底物序列nGR-5s 结合，底物序列nGR-5s 浓度为4 µmol/L；加入过量Pb2+（此处为40 µmol/L），室温酶切2 h 后的结果如图2B 所示。结果显示Lane 3 与Lane 6 在箭头所指位置的条带均有缺失，这说明nGR-5与bf-Cir-nGR-5 均表现出对nGR-5s 的明显酶切，但Cir-nGR-5 对应的Lane 9 的条带仍然可见，说明其酶切能力受到影响。随后，通过进一步延长酶切时间（过夜），再次对结果进行表征（如图2C），结果显示nGR-5s能被酶切，说明nGR-5序列环化后的Cir-nGR-5序列仍保留了原始序列的酶活性。

图2 基于凝胶电泳的nGR-5系列序列对nGR-5s酶切能力的表征Fig.2 The characterization of nGR-5s cut by nGR-5 series sequence through gel electrophoresis

结合已有文献报道［13］，进一步对nGR-5s序列进行荧光基团修饰（修饰后序列为nGR-5s-FQ），并通过测定其酶切前后的荧光信号变化来表征nGR-5 序列与Cir-nGR-5 序列的酶活性情况，其中nGR-5序列与Cir-nGR-5 序列也需进行猝灭基团修饰，修饰后序列为nGR-5Q 与Cir-nGR-5Q’，其序列修饰情况以及酶切流程示意图如图3A 所示。在表征实验中，由于Cir-nGR-5Q’序列合成时其序列含量有损失，故该酶切反应中底物序列的加入无须过量，而是以1∶2 的浓度比与酶序列结合，底物序列nGR-5s-FQ 的实际浓度为0.5 mol/L，Pb2+浓度为10 mol/L，室温酶切6 h 后的荧光表征结果如图3B 所示，Pb2+的加入能明显引起溶液荧光信号的增强，这也表明了nGR-5 序列与Cir-nGR-5 均具备一定的酶切活性。

图3 基于荧光分光光度计的nGR-5Q系列序列对nGR-5s-FQ的酶切能力表征Fig.3 Characterization of nGR-5s-FQ cut by nGR-5Q series sequence through fluorescence spectrophotometer

2.2.2nGR-5 脱氧核酶系列序列酶活性表现的表征为进一步表征Cir-nGR-5 序列的酶活性表现，结合课题组研究基础、实验条件以及研究成本等的相关情况，选择一条带有G-四联体的底物序列nGR-5whgs 开展相关实验（其序列组成如图4A 所示），并利用 G-四联体的特点实现对实验结果的可视化表征。

图4 nGR-5whgs酶切实验示意图以及基于比色实验的酶切条件优化Fig.4 Schematic diagram of nGR-5whgs cleavage experiment and its condition optimizing by colorimetric experiment

值得注意的是，本实验所引入的G-四联体序列源自课题组研究发现的一条发夹结构的Oxy28序列（相关研究数据尚未以研究论文的形式公开发表），该序列与Hemin 分子构成的复合物的催化活性受到发夹结构稳定性的影响，且其影响源自发夹结构上特定位置的A碱基（见图4A中虚线部分），该碱基在发夹结构形成后能与G-四联体结构靠近并促使其过氧化物酶活性增强，有助于表征nGR-5s 系列序列与底物的结合情况。

基于nGR-5whgs 底物序列的表征策略如图4B 所示（图中仅以nGR-5 序列为例，其他系列序列同理），nGR-5whgs 与酶链结合后，发夹结构被打开，末端G-四联体与Hemin 形成的复合物的过氧化物酶活性较低，当被酶切后，释放出hg序列后，其发夹结构被恢复，进而与Hemin 形成的复合物的过氧化物酶活性增强。此外，nGR-5whgs 由于存在一段游离的末端长链，其结构稳定性受到影响，会进一步降低背景信号。依据以上思路，可通过酶切前后混合溶液的过氧化物酶活性变化，表征nGR-5系列脱氧核酶的酶活性表现。

为保证后续表征实验的最佳效果，需对图4B 中检测方法进行条件优化。本文主要对酶切反应使用的缓冲液进行优化，结合不同文献报道［14-17］，考察了3 类常见的缓冲液类型（分别为HEPES、Tris 与PBS）以及缓冲液组成（缓冲液浓度与pH 值）对显色效果的影响。优化实验使用不含rA 碱基但序列组成一致的whg 序列和hg 序列模拟酶切反应前后的底物组成，并通过对比二者显色差异实现优化表征。表征结果如图4C所示，表明后续实验缓冲液以A3-7.4最佳。

基于图4B 的策略，对nGR-5、bf-Cir-nGR-5 以及Cir-nGR-5 三条序列酶的活性表现情况进行表征，结果如图5 所示。实验结果显示三条序列对改造后的底物序列nGR-5whgs 均有明显酶切，但三者不同的是，相比nGR-5序列，bf-Cir-nGR-5 与Cir-nGR-5 序列酶切后产物的拖尾现象更明显，推测为酶切后的条带与酶链形成多种结构所致。进一步对酶切样本进行显色，发现nGR-5序列的颜色变化符合设计预期，说明该策略用于表征nGR-5系列脱氧核酶的酶切能力是合理的。但是，bf-Cir-nGR-5与Cir-nGR-5 序列的显色情况却更为复杂，相比于nGR-5 序列，bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 与nGR-5whgs 结合后背景信号明显提升，结合凝胶电泳结果，说明这两者与底物序列的结合产物类型更多，影响底物上G-四联体结构的显色表现。由此可见，nGR-5whgs 与bf-Cir-nGR-5、Cir-nGR-5 两条酶链结合后，其G-四联体更容易受到酶链上其他碱基的影响，同时相比于bf-Cir-nGR-5，Cir-nGR-5上的碱基对G-四联体结构的影响更强，在结合后可能更容易受到序列上其他碱基的影响。

图5 基于凝胶电泳以及比色实验的nGR-5系列序列对nGR-5whgs酶切能力的表征Fig.5 Characterization of nGR-5whgs cut by nGR-5 series sequence through colorimetric experiment and gel electrophoresis

结合Cir-nGR-5 序列的异常表现进一步考察nGR-5whgs 序列的组成及其显色特性，发现nGR-5whgs 与Cir-nGR-5 结合后，其发夹结构被充分打开，Cir-nGR-5 延伸序列上的C 碱基（图6A 标红C 碱基区域）与G-四联体极为靠近，引起了该G-四联体结构与Hemin 复合物的过氧化物酶活性增强，且其增强效果高于发夹结构引起的A 碱基靠近。随后本文选择降低溶液盐离子浓度影响序列杂交表现的方式对该分析结果进行初步验证，结果如图6 所示，当酶切反应所用A3 缓冲液的浓度稀释12.5 倍后，Cir-nGR-5 序列与nGR-5whgs 结合后的显色深度变浅，但相比于bf-Cir-nGR-5 仍然较深，说明酶链与底物链结合的强弱直接影响G-四联体的显色表现，进一步证实了以上分析结果。

图6 Cir-nGR-5与nGR-5whgs结合后底物过氧化物酶活性增强原因的初步探究Fig.6 Preliminary study on the reasons for the enhanced peroxidase activity after the combination of Cir-nGR-5 and nGR-5whgs

由此可见，nGR-5 脱氧核酶环化后，脱氧核酶与底物序列之间的作用模式受到影响，这一特性可为构建新型基于脱氧核酶的生物传感器件提供新思路。

2.2.3 Cir-nGR-5 脱氧核酶环大小对其酶活性的影响由上述讨论可知，Cir-nGR-5 的酶活性相比nGR-5 仍受到一定的影响，综合各类可能的影响因素，进一步考察了Cir-nGR-5 脱氧核酶环的大小对其酶活性的影响。实验通过在Cir-nGR-5 序列原有碱基个数的基础上增加和减少4 个碱基，另外合成Cir-nGR-5+4b与Cir-nGR-5-4b两条序列，并结合凝胶电泳实验表征了三条序列对nGR-5whgs底物序列的酶切活性表现情况。其环形核酸合成与表征结果如图7所示，其中酶链与底物链浓度比为1∶2，酶切反应6 h 后的结果表明Cir-nGR-5+4b 的酶切能力略大于其他两条序列，这说明适当增加环部碱基个数能增强Cir-nGR-5序列的酶活性。

图7 基于凝胶电泳实验的Cir-nGR-5系列序列合成及其对nGR-5whgs酶切能力的表征Fig.7 Characterization of nGR-5whgs cut by Cir-nGR-5 series sequence and its synthesis results through gel electrophoresis

2.3 nGR-5脱氧核酶系列序列的稳定性表征

由图1C结果表明，相比于单链的bf-Cir-nGR-5序列，Cir-nGR-5具有更好的抗外切酶能力，故进一步通过延长酶切反应时间至12 h 考察其在外切酶溶液中的长时稳定效果，从图8A 所示结果可发现Cir-nGR-5在12 h内稳定存在，而单链脱氧核酶在1 h后几乎全部被酶切。结合脱氧核酶目前可能的应用场景，本文还对比考察了Cir-nGR-5 在自来水（室温）以及胎牛血清（FBS，75%，37oC）中的稳定性。图8B 为bf-Cir-nGR-5 与Cir-nGR-5 序列在自来水中的稳定性情况，结果显示Cir-nGR-5 相比bf-CirnGR-5 具有更好的稳定性，即便过了7 d，Cir-nGR-5 序列的降解也并不明显。此外，环形核酸在10%FBS 中的长时稳定性已被多次报道，本文通过进一步提高其体积分数至75%考察了nGR-5、bf-CirnGR-5 以及Cir-nGR-5 三条序列的稳定表现，结果表明环形脱氧核酶Cir-nGR-5 在6 h 后仍有条带保留，而单链脱氧核酶在2 h后已被酶切完毕。由此可见，环形脱氧核酶在提升核酸分子稳定性上具备一定优势。

图8 基于凝胶电泳表征的bf-Cir-nGR-5与Cir-nGR-5在不同环境下的结构稳定性Fig.8 Structural stability of bf-Cir-nGR-5 and Cir-nGR-5 in different environments by gel electrophoresis experiment

3 结 论

本文设计合成了一条环形脱氧核酶Cir-nGR-5，并表征了其酶活性以及结构稳定性。研究结果表明环形结构的引入能明显增强脱氧核酶结构的稳定性，具体表现在外切酶样稳定时长大于12 h、在自来水中稳定时长大于7 d 以及在75% FBS 中稳定时长为6 h 左右，远高于同类单链脱氧核酶。同时，环形结构的引入不会完全破坏原脱氧核酶的酶活性，但由于其增强了脱氧核酶与其底物序列的相互作用，也会对脱氧核酶原有的酶活性产生影响。但此影响可通过延长反应时间得以削弱，且在具体的生物传感器构建中，这一增强作用会影响传感器的信号表达，如本文对比了基于环形脱氧核酶与单链脱氧核酶分别构建的同类荧光生物传感器，底物序列被前者酶切后的荧光信号相比后者有明显增强，这一特性也为脱氧核酶生物传感器的设计提供了更多可能性。综上，环形结构能较好地改进脱氧核酶的稳定性，也能增强脱氧核酶与底物序列的相互作用，这将为开发基于脱氧核酶的相关生物传感器提供新思路。