基于内标型花瓣状间隙增强拉曼粒子的pH传感

张铭中，关鹏程，林嘉盛，许珊珊，张凡利，张月皎，李志勇，李剑锋，，，6*

（1．中国计量大学 光学与电子科技学院，浙江 杭州 310018；2．厦门大学 化学化工学院，福建 厦门 361005；3．厦门大学 材料学院，福建 厦门 361005；4．厦门大学第一附属医院，福建 厦门 361005；5．厦门大学 能源学院，福建 厦门 361005；6．嘉庚创新实验室，福建 厦门 361005）

汗液检测作为一项重要的生理监测方法，其应用前景十分广阔。通过汗液中丰富的生理信息，能够实现更有效的健康管理，不仅可提升监测效率，还提供了更舒适的监测方式［1］。同时，汗液检测也在推动医学和科学领域发展方面取得了显著进步，为疾病诊断、预防以及人体生理机制的深入研究提供了有力支持。其中对于汗液pH值的检测有助于评估身体的酸碱平衡，反映代谢健康和运动效果，同时可早期发现代谢性疾病风险，为个体化健康管理提供重要参考。因此，对汗液pH值无创检测的研究越来越多，如采用电化学［2-3］、比色法［4］等对汗液进行检测。但由于汗液的pH值变化较小，以上方法很难精准反应汗液pH值的变化趋势或检测成本较高。

表面增强拉曼散射（SERS）技术可通过表面增强效应显著提升拉曼光谱的信号强度［5］，其高灵敏度和单分子级别的检测能力，在汗液pH 值检测方面具有巨大潜力［6］，通过结合纳米材料和高灵敏度的光谱分析，能够实现微小样本中pH 值的准确测量［7］。SERS 的高度灵敏性使其能够捕捉pH 值的微小变化，对于生物体内的生理过程和疾病状态监测具有重要意义。此外，SERS 还具备快速［8］、非侵入性［9-10］和无标记［11］的优点，在实时汗液pH 值监测中有很大应用空间。Chung 等［6］采用热塑性聚氨酯（TPU）静电纺丝与金溅射涂层相结合的方法，制备出具有机械柔性的纳米纤维SERS活性衬底，所研发的SERS 汗液pH 传感器经pH 敏感分子活化后，展现出良好的分辨率，但该活性基底对汗液pH 检测的线性情况欠佳，需要开发更加稳定可靠的参考峰来校正信号波动。Lu 等［12］用含有内标分子信号的SERS基底检测汗液中的尿酸，得到了良好的线性响应曲线。

Zhang 等［13］报道了一种具有强“热点”的花瓣状间隙增强拉曼标签（PGERT），这种花瓣状壳层的间隙结构在638 nm 激光激发下的SERS增强因子可达5×109。除此之外，该粒子内部间隙与表面可以修饰具有不同作用的分子，有着极其广泛的应用前景。对于汗液pH值检测而言，良好的增强与稳定的信号校正均可提高信号的灵敏度与稳定性。

本文在文献［13］的基础上，以4-巯基苯甲氰（4-MBN）为内标，制备了一种内标型的PGERT。这种形貌的粒子，能够吸附更多的pH 敏感分子4-巯基苯甲酸（4-MBA），获得更强更稳定的拉曼信号，且内标分子提供了稳定可靠的参考峰来校正信号波动。首先，采用原位分析池建立pH值标准曲线，然后使用人工汗液作为样本验证标准曲线的准确性。接着以4-MBN 为标定特征峰，得到更为优越的校准曲线，以及更高的线性关系和测量精确度，这对于其在汗液pH传感器标定、拉曼光谱仪校准等方面的应用非常有利，基于内标型PGERT 的拉曼分析方法能够快速、准确地检测汗液中的pH 值，其实际应用也得到了验证［14-15］。此外，它还具有与其它技术相结合应用的潜力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

KQ5200DA 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），UVmini-1280 紫外可见光谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司），GeminiSEM 500 扫描电子显微镜（SEM），JEM-1400 透射电子显微镜（TEM），XploRA PLUS 高性能全自动拉曼光谱仪（HORIBA），LSP-02-2A 注射泵（LongerPump），PHS-3C pH计（上海雷磁）。

人工汗液、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）（上海源叶生物科技有限公司），抗坏血酸（AA）、硼氢化钠（NaBH4）（上海沪试环保试剂科技有限公司），氯金酸（HAuCl4·4H2O，国药集团化学试剂有限公司），4-巯基苯甲氰、4-巯基苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），十二水合磷酸氢二钠、四水合磷酸二氢钠（西陇科学股份有限公司），超纯水（18.2 MΩ，力康生物医疗科技控股有限公司）。

1.2 纳米粒子的合成

1.2.1 合成金种子首先合成金种子溶液［13］：在10 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 µL 4.86 mmol/L 的氯金酸溶液，并剧烈超声。在30 ℃条件下加入450 µL 0.02 mol/L 的NaBH4，超声混匀后静置1 h。

1.2.2 合成金纳米球在15 mL 0.1 mol/L 的CTAC 溶液中加入515 µL 7 mmol/L 的氯金酸溶液和75 µL 0.04 mol/L的AA溶液，随后添加100 µL稀释10倍的金种子溶液，并在40 ℃条件下持续搅拌1 h，得到约40 nm大小的金纳米球。

1.2.3 金纳米球改性在得到的10 mL金纳米球溶胶中加入500 µL 10 mmol/L的4-MBN 溶液，常温下超声处理20 min。之后使用0.05 mol/L CTAC 溶液进行洗涤，重复3次。最后，将经4-MBN 改性的金核重悬于5 mL 0.05 mol/L的CTAC溶液中。

1.2.4 生长花瓣状壳层将1 mL 4-MBN 改性后的金核溶胶加入到16 mL 0.05 mol/L CTAC 溶液、480µL 0.04 mol/L 抗坏血酸和960 µL 5 mmol/L HAuCl4的混合生长液中，加入0.5 µL 10 mmol/L 的4-MBN溶液之后，剧烈超声7 min，得到内部修饰了4-MBN 的花瓣状间隙增强纳米粒子溶液，用0.025 mol/L CTAC 溶液洗涤得到的溶液。取4 mL 按照上述方法合成的花瓣状间隙增强纳米粒子，加入500 µL 10 mmol/L 的4-MBA，超声反应10 min。用超纯水清洗两次，并将溶液定容至原体积的1/5，得到外部修饰了4-MBA的花瓣状间隙增强拉曼标签。具体制备过程如图1所示。

图1 PGERT的制备过程Fig.1 The procedure of PGERT

最后取20 µL PGERT 溶胶滴加在5 mm×5 mm 的金片（单晶硅片上蒸镀80 nm 厚度的金层）上烘干，制备成pH分析基底。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

2.1.1 SEM与TEM分析修饰有4-MBA的PGERT的SEM与TEM表征结果如图2A所示。从图中可以看到PGERT的外层形貌呈现出完整的花瓣状结构，其粒径约110 nm，且分散性较好。花瓣状壳层结构的PGERT具有丰富的孔隙结构、更多的热点和更大的比表面积，有助于待测物的牢固吸附和富集，从而提升检测灵敏度。

图2 PGERT的SEM和TEM图（A），金球修饰4-MBN前后的吸收光谱（B），PGERT修饰4-MBA前后的吸收光谱（C），分别修饰有4-MBA的PGERT与45 nm金球在相同浓度（1 nmol/L）下于1 710 cm-1处的SERS信号强度（D）Fig.2 The SEM & TEM image of PGERT（A），absorption spectra of gold nanoparticles before and after 4-MBN modification（B），absorption spectra of PGERT before and after 4-MBA modification（C），SERS signal intensity at 1 710 cm-1 of PGERT and 45 nm gold spheres modified with 4-MBA at 1 nmol/L（D）

2.1.2 PGERT 合成过程中的紫外-可见吸收光谱对粒子的吸收光谱进行了测试。修饰4-MBN 前金核的吸收光谱位于529 nm，将4-MBN 修饰到金球表面后，吸收光谱移至531 nm（图2B）。4-MBN 作为内标的花瓣状间隙增强纳米粒子在约672 nm 处出现紫外吸收峰，经pH 敏感分子4-MBA 活化后，紫外吸收峰红移至约675 nm（图2C）［5］。同样在1 nmol/L的浓度下，修饰有4-MBA的PGERT的SERS信号强度是修饰有4-MBA 的45 nm金球的122倍（图2D），即使用修饰有4-MBA 的PGERT作为基底可以获得更强的拉曼信号，有利于观察4-MBA拉曼峰相对强度的变化，在一定程度上提高分析的灵敏度与准确性。

2.2 pH标准曲线的测定与人工汗液的实际检测

2.2.1 原位测定pH 标准曲线为减少4-MBA 信号波动带来的影响，采用原位分析池测定pH 标准曲线以提高稳定性，即使拉曼聚焦点在基底同一个位置保持不变，用注射泵注入不同pH值（pH 5.0~8.0）的标准磷酸缓冲液（PB），使用波长638 nm的激发光源采集信号，采集条件为10 s，2.6 mW，测试装置如图3A 所示。根据拉曼信号标定pH 值时，以受pH 值影响较小的拉曼峰为参考峰，通过pH 活性峰与参考峰积分之后的强度比（I积分（pH活性峰）/I积分（参考峰））的变化趋势反应pH值的变化。

图3 原位测试示意图（A），修饰有4-MBA 的普通金球分析基底在不同pH 条件下的拉曼谱图（B）及不同pH 值条件下，其在1 710 cm-1处拉曼信号的变化谱图（C）以及I（1 710 cm-1）与I（1 080 cm-1）（D）和I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E）对pH值的拟合曲线Fig.3 Schematic of in-situ testing（A），Raman spectra of 4-MBA modified gold nanoparticles on a common gold substrate under different pH conditions（B），intensity of the 1 710 cm-1 Raman signal under different pH conditions（C），fitting curves of I（1 710 cm-1）/I （1 080 cm-1）（D） and I（1 710 cm-1）/ I（1 590 cm-1）（E） to pH

实验所涉及的拉曼峰归属如表 1 所示。在不同pH 值环境下，4-MBA 的羧基接受质子或释放质子，主要反应在1 710 cm-1（羧酸盐振动ʋ（COO-）［16］）处的拉曼峰上。而来自于苯环呼吸的1 080 cm-1和1 590 cm-1处的拉曼峰受pH值的影响较小，以其为参考峰考察pH活性峰相对强度的变化［17］。

修饰有4-MBA的普通金球（45 nm）制备的pH分析基底在不同pH条件下的拉曼光谱图如图3B所示。其在1 710 cm-1处的拉曼峰强度随着pH 值的升高而降低（图3C）。将得到的数据代入I积分（pH 活性峰）/I积分（参考峰）中（参考峰分别为1 080 cm-1和1 590 cm-1处的峰），通过计算得到I（1 710 cm-1）与I（1 080 cm-1）积分的比值以及该比值与pH 值的拟合曲线，其相关系数r2=0.97（图3D）。该结果的误差棒较大，说明准确度较低。而以I（1 710 cm-1）/I（1 590 cm-1）积分的比值拟合分析曲线时，r2=0.95（图3E）且误差棒较大。因此，用普通金球作为分析基底时不能精准体现pH值的变化趋势。

表1 含有内标分子的PGERT所涉及的拉曼峰归属Table 1 Assignment of Raman peaks associated with internal standard molecules in PGERT

对内标型花瓣状间隙增强拉曼粒子构建的pH 分析基底进行考察。在含有内标分子的PGERT 中，以内标分子4-MBN 在2 234 cm-1处的拉曼峰（氰基的伸缩振动ʋ（C≡N））作为参考峰。4-MBN 在环境中比4-MBA 更稳定，此外，4-MBN 在拉曼静默区的拉曼峰减少了杂质影响的可能性。修饰有4-MBA 的PGERT 在不同pH 值条件下的拉曼光谱如图4A 所示，随着pH 值的升高，4-MBA 在1 710 cm-1处的拉曼活性峰相对2 234 cm-1处的参考峰强度明显下降。随着pH值的变化，1 710、2 234 cm-1处的拉曼峰强度如图4B 所示，图4C 为I（1 710 cm-1）/I（2 234 cm-1）积分的比值与pH 值的拟合曲线。结果显示，含有内标的PGERT 得到了线性系数r2=0.99 的拟合曲线和误差棒较小的拟合结果，说明含有内标的PGERT 在标准PB缓冲液中可以更准确地反应所处环境的pH值。

图4 修饰有4-MBA的PGERT作为分析基底时在不同pH值条件下的拉曼谱图（A），1 710、2 234 cm-1处的拉曼信号强度随pH值的变化图（B），I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1）对pH值的拟合曲线（C）Fig.4 Raman spectra of PGERT modified with 4-MBA under different pH conditions（A），intensity of the 1 710，2 234 cm-1 Raman signals under different pH conditions（B），fitting curve of I（1 710 cm-1）/ I（2 234 cm-1） to pH value（C）

含有内标的PGERT 的pH 标准曲线有更好的线性关系，归因于其内部疏松多孔的“花瓣”间隙可以提供丰富的热点［18］，并使更多的4-MBA 修饰其上，提供了更强且稳定的4-MBA 信号，从而可获得更高的灵敏度。而以4-MBN 为内标分子，可提供相对稳定可靠的参考峰信号进行标准曲线校正，在外界条件变化时更具稳定性［19-20］。

2.2.2 汗液pH 值检测人体汗液含有多种成分，包括电解质、氨基酸、脂质、乳酸等，这些成分可能对实际pH 值测定产生影响。人工汗液的成分与正常人体汗液相似度高达99.99%，本文以人工汗液为实际样品考察所建基底的实用性。采用pH 计对4 份人工汗液进行测量，得到人工汗液的实际pH 值分别为5.06、5.63、6.58、7.06。

取1 µL 不同pH 值的人工汗液样品滴在附着有内标型PGERT 的pH 分析基底上，使用638 nm 波长的激发光进行信号采集，将得到的数据代入到公式I积分（pH 活性峰）/I积分（参考峰）中，并代入拟合方程，得到的pH 值分别为4.95±0.26、5.37±0.06、6.20±0.02、6.80±0.07，与pH 计的测得值基本一致，结果如表2 所示。基于内标型花瓣状间隙纳米拉曼标签的传感器仅需1 µL 即可实现人体汗液的高灵敏、可靠检测，具有实际应用价值。

表2 pH计与内标型PGERT基底汗液测得值的比较Table 2 Comparison of sweat pH values measured by pH meter and internal standard PGERT substrate

3 结 论

本文以4-MBA 为pH 探针分子，引入4-MBN 分子作为内标，制备了一种含有内标的花瓣状间隙拉曼纳米标签，并用于构建pH 分析基底，对其在汗液pH 传感中的适用性进行了研究。结果表明，含有内标的PGERT 可以稳定地测试汗液的pH 值，能在pH 5.0~8.0 之内提供精确传感（与实际pH 值的误差最大仅为7.17%），仅需1 µL 汗液即可实现测量。该标签在pH 值检测方面表现优异，其快的响应速度和高的灵敏度使之在实时监测生物体液pH值变化中具备出色的能力，在医学、运动生理学等领域具有潜在的应用价值。

含有内标的PGERT可以实现实时、连续的汗液分析，有助于个体的健康管理、运动调节和疾病监测，应用前景广阔［21-22］。将此类花瓣状间隙增强拉曼标签与可穿戴式汗液检测技术相结合（如水凝胶［2］、微流体芯片［23］、便携式设备［24］和皮肤贴片［25］等），将为健康监测和医学诊断领域带来新的可能性，在汗液检测和生物传感器领域具有新的应用前景。