原位合成Au/泡沫镍磁性基底用于表面增强拉曼快速检测血清中免疫抑制剂代谢物

刘尧尧，李朵朵，郭小玉，文 颖，杨海峰

（上海师范大学 化学与材料科学学院，上海 200234）

硫唑嘌呤（Azathioprine）是免疫抑制剂，临床用于恶性葡萄胎、急性白血病、绒毛膜上皮癌、红斑狼疮、血小板减少性紫癜、器官移植免疫抑制以及免疫治疗肿瘤与自身免疫性疾病等。其药理为硫唑嘌呤进入人体后，快速降解为代谢物6-巯基嘌呤（6-MP）。6-巯基嘌呤呈现嘌呤拮抗免疫抑制作用，能抑制腺嘌呤与鸟嘌呤合成，进而抑制合成相关DNA，达到抑制抗原敏感淋巴细胞增殖的作用，阻止其转化成免疫母细胞［1-2］。硫唑嘌呤原药在体内代谢快，很难直接检测。因此，定量检测血清中6-巯基嘌呤浓度，研究其药代动力学过程［3］，对指导患者合理用药和避免过度服用导致不良反应的临床意义重大。6-MP的常用检测方法有高效液相色谱（HPLC）法、分光光度法、电化学分析法和荧光光谱法等［4-8］，但上述方法存在无法快速检测或分析灵敏度不高的问题。

1928 年，拉曼观察到光非弹性碰撞现象，发现其频率位移与分子振动特征频率相关［9］。水分子拉曼散射效应弱、干扰小，拉曼光谱适合于分析水体系样品。但大多数分子的散射截面积小于10-30，拉曼技术难以用于常规分析。20 世纪70 年代，表面增强拉曼散射（SERS）现象被偶然发现，并揭示了其物理化学机理［10］，随着激光技术的发展，SERS 的应用场景被大大拓展。SERS 具有高灵敏度、分子特征性、样品用量少和无需复杂样品前处理的优点，又可实现无损分析［11］，有望成为药物代谢研究的重要分析手段［12-13］。

生物样本如血清、尿液等基质成分复杂，对检测其中有机小分子的背景干扰大。本文基于多孔泡沫镍片（0.25×0.25 cm2）原位还原制备纳米金，获得纳米金-泡沫镍基底（Au-NFs），可作为磁性SERS基底。该磁性基底呈现超顺磁特性，赋予其高的保存稳定性；基于磁分离，可有效减少共存物光谱的干扰，提高分析选择性；外加磁场，富集磁性基底，优化局域等离子场分布，增加了SERS 热点“hot spots”的形成，能进一步提高光谱检测灵敏度［14-15］。利用Au-NFs 快速SERS 分析6-巯基嘌呤，检出限低至1×10-9mol/L，能满足体内微量药物监测的要求。Au-NFs 磁性基底制备和用于硫唑嘌呤原药代谢产物6-巯基嘌呤SERS分析的示意图如图1。

图1 Au-NFs磁性基底合成及对6-MP分子检测示意图Fig.1 Schematic diagram of the preparation of magnetic Au-NFs substrates and SERS assay for 6-MP as azathioprine metabolite molecule

1 实验部分

1.1 试剂与材料

4-巯基吡啶（4-MPy，分析纯）和氯金酸（分析纯）购于国药试剂有限公司。6-巯基嘌呤（89.4%）购于中国标准品生物制品检定所。实验用水为三次去离子水。泡沫镍（孔径0.23 mm，厚度0.3 mm，苏州佳士德泡沫金属有限公司）用水洗净备用。玻璃器皿在王水溶液（盐酸∶硝酸=3∶1）中浸泡24 h，用水多次洗涤后干燥备用。人血清样品来自医院健康志愿者，在低温冰箱内（-20 ℃）保存备用。

1.2 仪器设备

用扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日本Hitachi 公司）表征Au-NFs 复合基底的形貌。利用X 射线能谱仪（EDS，S-4800，日本Hitachi 公司）分析复合基底的元素组成。用紫外-可见分光光度计（型号为7504，上海鑫茂仪器有限公司）采集金纳米粒子的表面等离子体共振光谱。采用SuperLabramⅡ型共聚焦显微激光拉曼仪（氦-氖离子激光器，半导体冷却的CCD 检测器，法国Dilor 公司）进行拉曼测定，每次光谱采集曝光时间为8 s，累积次数为3 次。使用液相色谱仪（LC20A，日本岛津公司）检测加标人血清中6-MP的含量。

1.3 磁性复合SERS基底制备

先用剪刀将泡沫镍剪成小片（0.25×0.25 cm2）。在室温下，将泡沫镍小片置于浓氨水中浸泡30 min，去除表面氧化层至呈现金属光泽。水洗后，在1% HAuCl4溶液中静置，反应10 min 后进行磁分离，水洗获得Au-NFs片备用。

1.4 磁性SERS基底检测4-MPy

稀释4-巯基吡啶标准溶液，获得不同浓度的分析溶液，将Au-NFs 浸入其中自组装，静置1 h 后磁分离，用吸水纸吸去多余液体，进行SERS检测。对氯金酸用量、反应时间进行了实验条件优化。

1.5 Au-NFs基底用于6-MP快速检测

分别配制5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9mol/L 的6-MP 溶液，在磁场优化条件下，利用Au-NFs片进行SERS定量性能考察。

将血清与甲醇1∶1（体积比）混合均匀，6 000 r/min 离心15 min。取上清液用去离子水稀释10 倍，6-MP 加标浓度分别为5×10-4、5×10-5、5×10-6mol/L，与基底等体积混合均匀，磁吸分离和聚集后进行SERS检测。

2 结果与讨论

2.1 Au-NFs磁性SERS基底的制备

Au-NFs 磁性SERS 基底制备过程的SEM 表征结果见图2。SEM 图（图2A、B）表明氨水作用后泡沫镍的表面光滑干净。在1%氯金酸溶液中反应10 min 后基底的SEM 图如图2C、D 所示，图中可见泡沫镍表面变得粗糙，形成了花簇状纳米金，且在表面均匀分布，有利于形成局域等离子场热点。Au-NFs磁性SERS基底的EDS表征结果表明有Au和Ni元素存在（图3A）。

图2 氨水处理后的泡沫镍（A、B）和Au-NFs磁性复合材料（C、D）的SEM表征图Fig.2 SEM characterizations of cleaned surface nickel foam by using ammonia solution（A，B）and Au-NFs magnetic composites（C，D）

图3 Au-NFs磁性SERS基底的EDS图与元素分布（A）以及超声处理后金纳米溶液的紫外表征结果（B）Fig.3 EDS image and elemental distribution of magnetic SERS substrates for Au-NFs（A），UV characterization of the Au nanoparticles removed from composites by supersonic assay（B）

将Au-NFs磁性基底放入有水的小烧杯中，超声处理15 min，取上层淡红色溶液进行紫外表征。图3B 中533 nm 处的峰归属于纳米金表面等离子体共振（SPR）吸收。综上所述，成功制备了磁性复合SERS基底Au-NFs。

2.2 基质制备条件的优化

以4-MPy 为探针分子，优化Au-NFs 磁性复合材料的制备条件，包括泡沫镍与1%氯金酸反应时间和氯金酸的浓度。从图4A 及图2D 的SEM 图中可见，不同反应时间（5、10、15 min）得到的复合基底形貌不同。反应时间过短（5 min）时，金纳米过于分散，不利于形成强的局域表面等离子场耦合，SERS效果不理想。延长反应时间（15 min），则导致纳米金过度团聚，大大减弱其SERS效应。从图4B 可见，1%氯金酸与泡沫镍片反应10 min获得的SERS信号最强。实验选择最佳反应时间为10 min。

图4 泡沫镍与1% HAuCl4静置反应不同时间Au-NFs上采集的4-MPy（10-5 mol/L）的SEM图（A）与SERS光谱（B）Fig.4 SEM images（A） and SERS spectra（B） of 4-MPy（10-5 mol/L） on Au-nickel foam magnetic composite synthesized by the reaction of nickel foam with 1% HAuCl4 for different time a：5 min；b：15 min

反应时间设为10 min，对反应中氯金酸溶液的用量（0.1%、1%、4%和5%）进行了优化。结果显示，氯金酸溶液浓度过低时，泡沫镍表面的粗糙度变化小，形成的纳米金形貌无规则；浓度过高时，在泡沫镍表面有大量的针尖状纳米金生成，并严重堆积，不利于SERS检测。将泡沫镍与不同浓度的氯金酸反应10 min后检测10-5mol/L的4-巯基吡啶，图5显示用1%氯金酸溶液反应制得的基底SERS效应最优。

图5 泡沫镍与不同浓度 HAuCl4 静置反应10 min获得不同Au-NFs基底上4-MPy的SERS光谱Fig.5 SERS spectra of Au-nickel foam magnetic composite synthesized by the reaction of nickel foam in different concentrations of HAuCl4 solutions for 10 min and 4-MPy（10-5 mol/L） as Raman probe

2.3 基于磁性Au-NFs基底检测4-MPy

采用在最优条件下制得的Au-NFs 磁性基底检测不同浓度的4-MPy 溶液，如图6A 所示，其可以检测低至1×10-9mol/L 的4-MPy，证明该基底的灵敏度很高。选择1 577.8 cm-1处的峰值强度，绘制标准曲线（如图6B）。在5×10-5~5×10-9mol/L 范围内线性良好（r2=0.946），检出限（S/N=3）为5×10-9mol/L。

图6 最优条件下制得Au-NFs磁性复合基底检测不同浓度4-MPy溶液的SERS光谱（A）；基于1 577 cm-1处SERS峰值强度和相应浓度4-MPy绘制的标准曲线（B）Fig.6 SERS spectra of 4-MPy solutions with different concentrations on the optimal Au-NFs magnetic composite（A），standard curve plotted based on the peak intensities of SERS at 1 577 cm-1 and the corresponding concentrations of 4-MPy solutions（B）concentration of 4-MPy（a-f）：5×10-5，5×10-6，5×10-7，5×10-8，5×10-9，1×10-9 mol/L

考察了基底的稳定性，实验结果显示，基底在25 ℃下储存13 天后，检测4-MPy（10-5mol/L）的SERS强度基本保持稳定，相对标准偏差为3.1%。因此，Au-NFs基底具有良好的稳定性。

2.4 基于磁性Au-NFs基底检测6-MP

考察了基于Au-NFs 磁性基底对6-MP SERS 分析的定量性能。图7 为固体6-MP 的常规拉曼光谱及SERS光谱图，比较可见，436 cm-1处的拉曼峰来自C—S的变形振动，863 cm-1处的峰可归属为υC8-H+υN7-C8+υN9-C8组合振动，证明6-MP分子以Au—S键吸附在金表面上。在1 001 cm-1和1 141 cm-1附近的峰是嘌呤环的呼吸振动；1 330 cm-1处的SERS峰归属为C5-N7变形振动；1 260 cm-1和1 281 cm-1处的拉曼峰分别归属于C2-N1-C6 和N1-C2-N3 的变形振动；1 399 cm-1处的峰对应于H-C8-N9 的变形振动［14］。

图7 固体 6-MP的拉曼光谱（蓝）及最优Au-NFs磁性基底测得的SERS光谱（红）Fig.7 Raman spectrum of solid 6-MP（blue） and SERS spectrum of 6-MP on the optimal substrate（red）inset is the structure of 6-MP

利用不同浓度梯度6-MP溶液与Au-NFs磁性基底孵化组装，磁富集优化后，采集SERS光谱图。如图8A 所示，在大于1 200 cm-1之后的范围内，空白基底无明显的背景信号，因此，以1 260 cm-1处的特征峰进行6-MP 的定量分析，可避免干扰。图8B 为对应的峰强度与浓度关系图，如内插图所示，其在5×10-7~1×10-8mol/L浓度范围内呈线性关系（r2=0.94），检出限可达1×10-9mol/L。

图8 基于Au-NFs复合基底检测不同浓度6-MP溶液以及基底空白的SERS光谱（A），1 260 cm-1处的峰强与6-MP浓度关系图（B）Fig.8 SERS spectra of different concentrations of 6-MP solutions and blank substrate on Au-NFs composite substrates（A），and the plot on SERS peak intensities at 1 260 cm-1 versus 6-MP concentrations （B）concentration of 6-MP（a-g）：5×10-5，5×10-6，5×10-7，5×10-8，5×10-9，1×10-9 mol/L and blank substrate；the inset is the linear relationship between the peak intensity and lgc（6-MP） from 5×10-7 to 1×10-8 mol/L（B）

基于Au-NFs 基底，采用SERS 检测了人血清中加标6-MP 的模拟样品。如图9 所示，血清中的6-MP 浓度低至5×10-6mol/L 仍有较强的拉曼信号。利用公式P=（C2-C1）/C3×100%估算加标回收率，其中，P为回收率，C1为未加标空白样中的6-MP 含量，C2为加标后样品的6-MP 测定值，C3代表加标值。结果显示，SERS 分析和HPLC 分析加标1×10-5mol/L 6-MP 的回收率分别为94.8%和95.8%，均在合理范围内，验证了基于Au-NFs 基底SERS方法的可靠性。但HPLC 无法检出人血清中更低浓度的6-MP。本SERS方法检测血清加标nmol/L浓度水平的6-MP，其回收率为92.8%~107%（表1），表明基于Au-NFs 基底，磁优化后检测6-MP 的分析可靠性好，无需复杂的样品前处理。

图9 Au-NFs磁性基底检测血清中不同浓度6-MP的SERS谱图Fig.9 SERS spectra of different concentrations of 6-MP in serum detected by Au-NFs magnetic substrate

配制血清中可能存在的干扰物质与6-MP 混合溶液如下：1×10-6mol/L 6-MP、1×10-6mol/L 多巴胺（DA）、1×10-6mol/L 抗坏血酸（AA）、1×10-3mol/L 葡萄糖（Glucose）和5×10-4mol/L 半胱氨酸（Cysteine）。如图10 所示，基于1 298 cm-1处6-MP 的特征SERS 峰定量，在磁性基底Au-NFs 上分析6-MP 具有良好的选择性。

图10 Au-NFs基底检测1×10-6 mol/L 6-MP、1×10-6 mol/L DA、1×10-6 mol/L AA、1×10-3 mol/L 葡萄糖和 5×10-4 mol/L 半胱氨酸的SERS图（A）以及基于1 298 cm-1处峰值强度统计（B）Fig.10 SERS spectra of 1×10-6 mol/L 6-MP，1×10-6 mol/L DA，1×10-6 mol/L AA，1×10-3 mol/L glucose，and 5×10-4 mol/L cysteine detected by Au-NFs substrate（A），and corresponding statistical bars based on the peak intensities at 1 298 cm- 1（B）

与文献中SERS 基底检测6-MP 的方法进行了分析性能比较。如表2 所示，基于Au-NFs 基底SERS方法有较低的检出限、较宽的线性范围及较高的回收率，且基底制备过程简单快速，可用于临床代谢药物检测。

表2 不同SERS基底用于检测6-MP的方法性能比较Table 2 Method performance comparison of SERS detection of 6-MP

3 结 论

本研究原位制备的磁性基底Au-NFs具有高的SERS活性，分析6-巯基嘌呤的检出限低至1×10-9mol/L。利用磁富集分离和磁优化基底聚集，能实现对血清中免疫抑制剂硫唑嘌呤代谢物6-巯基嘌呤的快速和高灵敏定量分析，血清中加标6-巯基嘌呤经SERS 检测的回收率为92.8%~108%，表明方法可靠。该分析策略结合便携式拉曼，有望为临床治疗提供高灵敏、快速的药物代谢检测方法。