组蛋白密码在骨髓增生异常综合征中的研究进展△

王冬琴，任建业

上海中医药大学附属市中医医院血液科，上海 2000710

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）由一组具有骨髓衰竭特征的异质性骨髓肿瘤组成，主要临床特征包括造血功能障碍、形态学发育不良和外周血细胞减少等[1]。伴有多系血细胞减少、骨髓原始细胞比例升高或特征性染色体异常的MDS 患者通常会迅速进展为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML），最终在未进行骨髓移植的情况下死亡[2]。组蛋白修饰是一种重要的表观标志，而组蛋白密码是组蛋白修饰在时间和空间上的组合，由组蛋白非结构化的氨基酸末端（N 端）尾巴空间位置、修饰类型、基团数量及修饰发生的时间共同构成，常见的组蛋白修饰存在于不同类型修饰酶作用环节的翻译过程中。骨髓肿瘤细胞核内各种效应蛋白与组蛋白修饰后的相应靶点结合，控制着MDS 细胞核染色体结构和基因表达调控等表观遗传现象，进而介导肿瘤细胞生长、凋亡、自噬及免疫反应等生命过程，因此组蛋白密码变换在MDS 发生发展过程中具有关键作用，研究相关分子标志物有助于理解MDS 的生物学行为，为MDS 的诊治提供重要信息。本文对组蛋白密码在MDS 中的研究进展进行综述。

1 组蛋白甲基化与MDS

组蛋白甲基转移酶及去甲基化酶能够动态调节组蛋白3（histone 3，H3）或组蛋白4（histone 4，H4）N 端精氨酸R1、R2 位点和赖氨酸K1、K2、K3残基的甲基化水平，其中K 位点的甲基化由组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase，HKMT）和组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）或含有Jumonji 结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶蛋白家族共同催化完成。根据各位点的甲基化基团数目，赖氨酸残基可单甲基化（me1）、双甲基化（me2，对称或非对称）和三甲基化（me3）。精氨酸残基同样能够被单甲基化和双甲基化修饰，主要由蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）家族部分成员催化完成。组蛋白的K位点甲基化是迄今为止MDS 研究最为广泛的一组组蛋白密码形式。目前已有靶向组蛋白甲基转移酶的抑制剂，其中一些已在AML 中显示出抗肿瘤活性。

1.1 组蛋白3 赖氨酸4（lysine 4 of histone 3，H3K4）甲基化

H3K4 可以发生单甲基化（H3K4me）、双甲基化（H3K4me2）及三甲基化（H3K4me3），由赖氨酸甲基转移酶2（lysine methyltransferase 2，KMT2）家族成员混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）蛋白系列催化，MLL 蛋白系列包括MLL1（KMT2A）、MLL2（KMT2B）、MLL3（KMT2C）、MLL4（KMT2D）、MLL5（KMT2E）、SET 结构域蛋白1A（SET domain containing 1A，SET1A，也称KMT2F）和SET 结构域蛋白1B（SET domain containing 1B，SET1B，也称KMT2G）以及缺失的、小的、同源异形蛋白1（absent small and homeotic disks protein 1 homolog，ASH1，也称KMT2H）。H3K4me 受ASXL 转录调节因子1（ASXL transcriptional regulator 1，ASXL1）-宿主细胞因子C1（host cell factor C1，HCF1）-O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶[O-linked N-acetylglucosamine（GlcNAc）transferase，OGT]蛋白复合物调节，参与骨髓髓系祖细胞分化及基因剪接，存在于转录基因的启动子中，已被证明参与造血细胞分化[3]。Wei 等[4]对原发性MDS 患者的骨髓细胞采用染色质免疫共沉淀联合全基因组测序分析发现，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和先天免疫信号转导通路涉及的启动子区域中H3K4me3 高度活化，证实H3K4me3通过介导NF-κB 和先天免疫相关基因的表达参与MDS 发生。对H3K4 甲基化修饰酶进行分析发现，MDS 患者体内11 号染色体长臂2 区3 带易位区域存在MLL基因及其侧翼区域缺失，使用单核苷酸多态性阵列对细胞核型进行检测发现，MLL1基因串联复制提示预后不良[5-8]。同时，研究发现，在MLL3 催化失活的工程小鼠模型中，造血细胞分化受到抑制，其向粒细胞/巨噬细胞谱系发生显著转变，并表现出骨髓浸润和次级淋巴器官扩大现象，7 号染色体缺失或长臂缺失是MDS 患者常见的染色体异常，其中q36.1 是7 号染色体长臂中一个关键的缺失片段，囊括了编码MLL3 和MLL5 的基因[9]。有趣的是，敲低17 号染色体上的肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）基因后，骨髓细胞中的MLL3 和神经纤维蛋白1 会在小鼠中诱导AML表型[10]。此外，MLL1基因重排与儿童及成人白血病有关。进一步对其组蛋白去甲基化酶全基因组芯片测序分析发现，组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域3（jumonji domain containing 3，JMJD3，也称KDM6b）过表达能够明显激活固有免疫，使小鼠具有MDS 表型[11]。组蛋白去甲基化酶LSD1 位于包含REST 辅抑制因子1（REST corepressor 1，COREST）、组蛋白脱乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）和组蛋白脱乙酰酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）的转录抑制复合物中，其具有去除H3K4me、H3K4me2 活性，抑制COREST 和LSD1 表达，阻断红细胞、巨核细胞、粒细胞及造血祖细胞分化的作用。LSD1 在MDS 患者中的表达水平明显高于健康者，抑制LSD1 的表达能够激活沉默的表观遗传基因或导致MDS 细胞凋亡。Sugino 等[12]研究发现，LSD1 抑制剂能够通过激活超级增强子改善MDS 相关的复杂核型。

1.2 组蛋白3 赖氨酸9（lysine 9 of histone 3，H3K9）甲基化

H3K9 甲基化是转录沉默的一个非常保守的标志，可发生单甲基化（H3K9me）、双甲基化（H3K9me2）及三甲基化（H3K9me3），由赖氨酸甲基转移酶1（lysine methyltransferase 1，KMT1）家族成员花斑3-9 抑制因子同源物1（suppressor of variegation 3-9 homolog 1，SUV39H1，也称KMT1A）、花斑3-9 抑制因子同源物2（suppressor of variegation 3-9 homolog 2，SUV39H2，也称KMT1B）、常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2，EHMT2，也称G9A、KMT1C）、常染色质组蛋白甲基转移酶1（euchromatic histone methyltransferase 1，EHMT1，也称GLP、KMT1D）、SET 结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶1（SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1，也称ESET、KMT1E）以及视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指蛋白（retinoblastoma protein-binding zinc finger protein，RIZ，也称KMT8）等催化。原癌基因亲嗜性病毒整合位点1（ecotropic viral integration site 1，EVI1）异常激活可导致MDS 发生，其可与SUV39H1 及G9A 相互作用，且与骨髓发育不良密切相关[13]。SETDB1 通过调控H3K9me 水平抑制非造血基因异位激活，这对于维持造血干细胞/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）数量至关重要。SETDB1 缺失可造成内源逆转录病毒（endogenous retrovirus，ERV）活化，引起HSPC 中的非造血基因异位激活，从而导致HSPC 快速消耗。Ropa 等[14]研究发现，SETDB1 缺失能够导致正常骨髓细胞转化为具有AML 特征的肿瘤细胞，而肿瘤细胞中SETDB1 缺乏及H3K9 甲基化减少会解除对ERV 的沉默作用，继而引发细胞死亡。H3K9me 也可通过与H3 和H4 乙酰化相关蛋白相互作用影响基因转录。武立鹏[15]的研究发现，曾被用于治疗MDS 及AML 的组蛋白去乙酰化酶抑制剂缩酚酸肽（depsipeptide）可引起G9A 和SUV39H1 表达下调，进一步导致靶基因启动子区附近H3K9me2/3 水平下降，使结合在该区域的异染色质蛋白数量减少，从而导致该区域的DNA 甲基转移酶募集减少，DNA 甲基化水平下降，发挥治疗作用。

2 组蛋白乙酰化与MDS

组蛋白乙酰化主要发生在H3 或H4 的N 端比较保守的赖氨酸位置，不仅与基因转录有关，还影响DNA 复制和修复。组蛋白乙酰化作用是指组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyltransferase，HAT）通过使组蛋白赖氨酸残基乙酰化，中和组蛋白电荷，弱化与DNA 的相互作用，进而疏松染色质结构，为招募转录因子提供锚定位点，最终激活基因转录；反之HDAC 使组蛋白去乙酰化，抑制基因转录。

2.1 组蛋白3 赖氨酸9 乙酰化（lysine 9 of histone 3 acetylation，H3K9ac）

H3K9ac 水平由多种乙酰化酶调节，其中Ⅰ类HDAC1 和Ⅱ类HDAC2 发挥了重要的调节作用，HDAC1 在难治性AML 患者和耐药AML 细胞中的表达显著上调[16]。转录抑制因子独立生长因子1（growth factor independent 1，GFI1）及其变异体GFI1-36N 负责将HDAC1 和HDAC2 招募到肿瘤基因位点上，导致H3K9ac 减少，反之则引起H3K9ac增加[17]。MDS 患者中GFI1 和GFI1-36N 低表达，有研究将核孔蛋白98（nucleoporin 98，NUP98）-同源盒D13（homeobox D13，HOXD13）转基因MDS/AML小鼠模型与GFI1-WT、GFI1-KD 或GFI1-36N 小鼠杂交，发现GFI1-KD 或GFI1-36N 低表达的小鼠H3K9ac 水平增加，而HAT 抑制剂的使用阻碍了细胞生长，解释了H3K9ac 促进AML 发展的原因[18]。HDAC1 抑制剂伏立诺他（SAHA）被证明对恶性血液肿瘤细胞具有潜在的抑制作用，已通过美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证，并在临床上广泛应用。诱导细胞凋亡是目前临床治疗MDS 的重要途径之一，SAHA 能够显著增加MDS 细胞系SKM-1 内H3K9ac 水平，且随着剂量的递增，细胞周期缩短且细胞凋亡增加[19-20]。另有研究发现，与健康者相比，高危组MDS 患者骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）中NF-κB 活化水平及抗凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia- 2，Bcl-2）表达水平均升高，细胞凋亡率降低，而HDAC 抑制剂能够显著增加BMMNC 凋亡水平，其原因可能与H3K9ac 水平改变有关[21-23]。

2.2 组蛋白4 赖氨酸16 乙酰化（lysine 16 of histone 4 acetylation，H4K16ac）

Zeng 等[24]对不同危险分层的MDS 患者骨髓CD34+细胞中H4 乙酰化水平及其调节酶HAT、HDAC 活性进行检测，结果发现，中低危MDS 患者骨髓CD34+细胞H4 乙酰化、HAT 水平均高于健康者及高危MDS 患者，而HDAC 活性低于高危MDS患者，表明H4 乙酰化参与了MDS 的发生发展过程。 另有研究发现，MDS 患者BMMNC 中H4K16ac 水平低于健康者[25-26]。沙利度胺是临床上改善中低危MDS 患者贫血的主要药物。Aerbajinai 等[27]应用沙利度胺处理MDS 患者原代骨髓CD34+细胞48 h，结果发现，其增加了组蛋白H4 乙酰化，提高了活性氧水平，并激活了p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路；应用抗氧化酶过氧化氢酶和细胞内羟基清除剂二甲基硫脲预处理细胞，消除了沙利度胺诱导的p38 MAPK 活化、组蛋白H4 乙酰化及γ-珠蛋白表达，表明H4 乙酰化、活性氧和γ-珠蛋白水平增加及p38 MAPK 信号通路激活是沙利度胺调控红细胞分化过程的重要机制。

3 组蛋白泛素化与MDS

哺乳动物组蛋白泛素化位点位于组蛋白2A（histone 2A，H2A）氨基末端K119 残基和组蛋白2B（histone 2B，H2B）羧基末端K120 残基。H2A 赖氨酸119 泛素化（ubiquitination of H2A lysine 119，H2AK119ub）大量富集在不活跃的近着丝粒区、失活的X 染色体和沉默的发育基因区域，主要由泛素化酶环指蛋白1A（ring finger protein 1A，RNF1，也称RING1A）、Cbl 及去泛素化酶泛素特异性肽酶16（ubiquitin specific peptidase 16，USP16）、MYSM1等共同调节，在造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）增殖和分化过程中发挥重要作用。H2B赖氨酸120 泛素化（ubiquitination of H2B lysine 120，H2BK120ub）由特异性泛素连接酶环指蛋白20（ring finger protein 20，RNF20）调控，并不是转录所必需的，而是在调节核小体动力学、DNA 损伤反应和其他组蛋白修饰酶活性等过程中发挥特殊作用。有研究表明，ubH2A、ubH2B 能够使组蛋白3赖氨酸79（lysine 79 of histone 3，H3K79）、H3K4 甲基化增加或聚集，进而阻止蛋白质与常染色质活跃的区域结合，导致基因沉默[28]。

3.1 H2A 泛素化

RING1A 是ubH2A 连接酶多梳抑制复合体1的关键成分，在CD34+骨髓祖细胞及高危MDS 患者中过表达，原代CD34+细胞中其失活增强了红系分化，应用RING1A 抑制剂能够降低MDS 患者和健康者中CD34+细胞的集落形成能力，表明其在MDS 红系发育缺陷中发挥作用[29]。MDS 患者骨髓HSC 和祖细胞的芯片和RNA 测序结果表明，H2A去泛素化（anti-ubiquitination of H2A，Anti-ubH2A）连接酶之一USP16 可与许多重要的造血调节因子结合，敲除USP16靶点和调控基因——细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）的表达，改变了HSC的细胞周期和分化缺陷，表明USP16缺失改变了转录/染色体组织、免疫反应、造血/淋巴器官发育和骨髓/白细胞分化中基因的表达，尽管不会改变HSC 的数量，但引起成熟细胞和祖细胞数量显著减少[30]。另外一个Anti-ubH2A 连接酶MYSM1 是调控B 细胞分化和功能的重要分子[31]。MYSM1缺陷型纯合子小鼠中脾细胞、骨髓细胞数量均少于同源野生型小鼠及杂合子小鼠，并伴有血小板中度增多和贫血[32-33]。同时，有研究表明，MYSM1 对维持HSC 的静息状态具有非常重要的作用，其缺陷可引起静息态的HSC 大量进入S 期，导致异常增殖的HSC 凋亡增加，并最终引起HSC 和骨髓细胞总数减少[34]。遗憾的是，目前并无H2A 与MDS发病直接相关的证据。

3.2 H2B 泛素化

MLL-AF9 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog，NRAS）G12D 共同驱动的基因工程AML 小鼠模型验证了RNF20是MLL-AF9 白血病生长所必需的基因之一；携带MLL重排的人类白血病细胞系的增殖也依赖于RNF20；转录组测序分析结果表明，在RNF20 受到抑制时，MLL-AF9转录靶标表达下调，包括同源盒A9（homeobox A9，HOXA9）、同源盒A10（homeobox A10，HOXA10）、Meis 同源盒1（Meis homeobox 1，MEIS1）和心肌细胞增强因子2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C），表现效果类似于抑制类端粒沉默干扰体1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L）；抑制RNF20 的表达或消除整体ubH2B 同样能够使白血病细胞停滞在细胞周期的G1/G0阶段，诱发MDS/AML 表型肿瘤细胞，以上证据表明RNF20 是AML 发生的染色质调节因子[35-36]。核小体上ubH2B 可增强H3K4 和H3K79 相关甲基转移酶的催化活性，研究发现RNF20 在MLL融合靶基因共转录区域富集，引发甲基转移酶DOT1L 介导的H3K79 甲基化在HOXA9 和MEIS1 处聚集，从而使白血病细胞依赖RNF20 来维持其致癌转录程序[37]。

4 组蛋白其他修饰与MDS

组蛋白的修饰方式还包括磷酸化、类泛素化、二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等，其研究主要集中于实体肿瘤，在血液肿瘤乃至HSC 恶性克隆演变过程中的作用目前鲜有文献提及。组蛋白磷酸化具有修复DNA 损伤、介导基因转录和染色质凝集等多方面功能。乔婷婷等[38]研究证实，H2A 磷酸化作用参与白血病细胞诱导自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞的凋亡过程。双泛素化/类泛素化连接酶TOP1 结合精氨酸/丝氨酸富蛋白（TOP1 binding arginine/serine rich protein，TOPORS）的缺失通过调节DNA 损伤反应导致小鼠遗传不稳定和恶性肿瘤发生率增加[39]。有研究采用全基因组测序技术发现，靶向TOPORS 可使MDS 和AML 细胞易发生DNA 损伤缺陷，并提高肿瘤细胞对阿扎胞苷的敏感性，表明去甲基化剂和类泛素化抑制剂之间具有协同作用[40]。二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等组蛋白修饰主要与肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程密切相关，现阶段相关研究较少。

5 小结与展望

特定的组蛋白修饰能够使MDS 的组蛋白密码发生改变，使其与核DNA 结合区由紧变松，靶基因暴露并与转录复合物发生作用，从而调控核基因转录进程及染色体相关事件[41-42]。有研究报道，编码表观遗传修饰蛋白的基因在70%以上的MDS 患者中发生突变，基因突变导致参与催化组蛋白修饰过程的相关转移酶的生成或结构异常，间接引起细胞组蛋白修饰水平改变[43]。但截至目前，关于MDS组蛋白的研究主要集中在甲基化及乙酰化层面，血液系统中关于组蛋白泛素化的研究仅限于HSC，与磷酸化、类泛素化、二磷酸腺苷核糖基化、羰基化等有关的文献屈指可数，相信对组蛋白密码的研究将为MDS 发病机制研究、临床诊断、分期、预后评估、复发评估、疗效评价等提供更加有力的证据。

此外，组蛋白密码在MDS 中值得深入研究，其是一个复杂巨大的调节网络，不仅是时间维度的单个组蛋白修饰与疾病之间关系的研究，各种修饰之间既存在协同和级联效应，又互相拮抗，包括组蛋白相同残基修饰之间的调节、不同组蛋白或不同残基修饰之间的调节，甚至是多个疾病进程、多维度的多个组蛋白、多个残基的排列组合[44-45]。但迄今为止，放眼肿瘤研究及其他疾病研究领域中关于以相关修饰酶为靶标的组蛋白修饰机制，特别是组蛋白修饰间调节的相关报道，还不是很具体，且机制还不太清楚，更少涉及逆转已被修饰的组蛋白的研究，该原因可能与组学技术及相关技术发展和普及程度有限有关。因此，阐明组蛋白修饰调节机制任重道远。