LC-MS测定二芳基吡唑类衍生物中的4-磺酰胺基苯肼和磺胺

于 梦，孙 清，王金虎，孙 玲

（山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101）

作为重要的中间体，吡唑类化合物广泛用于药物的合成和研制[1-3]。吡唑类化合物具有抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理活性[4-7]，已有吡唑类化合物作为药物上市或进入临床研究，如抗炎药物塞来昔布、抗菌药物磺胺苯吡唑，抗高血压药物利奥西呱、抗癌药物蒽吡唑类等[8-10]。合成人员参考相关文献以选择性COX-2抑制剂塞来昔布为模型化合物，设计合成了多个二芳基取代的吡唑衍生物[11-13]。合成中间体4-磺酰胺基苯肼含遗传毒性警示结构，其起始物料磺胺有较大毒性且不易代谢[14-16]，后续反应中会生成有遗传毒性警示结构的偶氮化合物。本文建立了采用液质联用技术测定二芳基吡唑类衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量的方法[17-18]，对两种杂质进行严格控制。杂质信息见表1。

表1 两种杂质信息

1 仪器与试药

1.1 仪器

UPLC-Q-Exactive Orbitrap液质联用系统（美国Thermo）；XS205DU十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo）；Seven Excllence多参数测定仪（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 试药

二芳基吡唑类衍生物（自制）；4-磺酰胺基苯肼盐酸盐对照品（加拿大Toronto Research Chemicals，批号：1-QL-68-1，纯度：98 %）；磺胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100024-201103，纯度：99.2 %）；甲醇（色谱纯，康科德）；醋酸铵（分析纯，国药集团）；醋酸（色谱纯，国药集团）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil Ph-3苯基柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相：0.01 mol/L醋酸铵缓冲溶液（pH 4.0）-甲醇，按表2进行梯度洗脱；流速：0.5 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：5 μl；运行设置：切换阀控制5 min后流出液不再进入质谱检测器。

表2 梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件 离子源：加热电喷雾离子源（H-ESI）；载气：氮气；离子传输管温度：320 ℃；辅助气加热温度：310 ℃；鞘气压力：35 psi；S-lens RF水平：50；辅助气压力：10 arb；喷雾电压：3.6 kV；扫描方式：选择离子监测，0～5 min：[M+Na]＋m/z210.0，[M+Na]＋m/z195.0，见图1。

图1 4-磺酰胺基苯肼（A）和磺胺（B）质谱图

图2 4-磺酰胺基苯肼（A）和磺胺（B）HPLC图谱

2.1.3 溶液的配制 对照品溶液的制备：取4-磺酰氨基苯肼和磺胺杂质对照品10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用甲醇制成各自储备液。精密移取各对照品储备液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品储备液。取混合对照品储备液适量，用甲醇逐步稀释制成每1 ml含4-磺酰胺基苯肼5 ng、磺胺5 ng的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取二芳基吡唑类衍生物适量，精密称定，用甲醇溶液溶解并制成每1 ml中含2 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2 验证结果

2.2.1 专属性 取空白溶剂和对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果表明4-磺酰胺基苯肼的保留时间为2.84 min，磺胺的保留时间为4.37 min，空白溶剂不干扰待测成分的测定。

2.2.2 溶液稳定性 取2.1.3项下对照品溶液，放置12 h，分别在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h进样测定。4-磺酰胺基苯肼峰面积的RSD为5.28 %，磺胺峰面积的RSD为3.39 %，结果表明对照品溶液在12 h内稳定。

2.2.3 检测限和定量限 取2.1.3项下对照品溶液，用甲醇逐级稀释至信噪比（S/N）接近10和3，确定4-磺酰胺基苯肼和磺胺的定量限和检测限。结果对磺酰氨基苯肼和磺胺的定量限分别为0.4915 ng/ml和0.5079 ng/ml，对磺酰氨基苯肼和磺胺的检测限分别为0.1474 ng/ml和0.1524 ng/ml。

2.2.4 线性 取混合对照品储备液5 ml，置100 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为线性储备液。分别精密移取线性储备液1，2，4，6 ml置100 ml量瓶中，精密移取线性储备液1，2，3 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀释制成系列浓度的溶液，作为线性样品溶液。分别量取5 μl注入液质联用色谱仪，记录峰面积。以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归。结果对磺酰氨基苯肼在0.4915～14.7441 ng/ml浓度范围内线性关系良好，磺胺在0.5079～15.2384 ng/ml浓度范围内线性关系良好，具体结果见表3。

2.2.5 回收率试验 取混合对照品储备液5 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为回收率储备液。精密称取二芳基吡唑类衍生物约20 mg，置10 ml量瓶中，共9份，分为3组，每组分别加入0.1，1，2 ml回收率储备液，甲醇溶解并稀释至刻度，即得回收率样品溶液，另按2.1.3项下方法配制对照品溶液。分别精密量取上述溶液5 μl，注入液质联用色谱仪，按2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算各杂质的含量，并计算其回收率，结果4-磺酰胺基苯肼和磺胺回收率分别为106.96 %和106.71 %，RSD分别为6.03 %和7.94 %，符合要求，具体结果见表4。

表4 回收率试验结果

2.2.6 精密度试验

2.2.6.1 仪器精密度 取同一份对照品溶液，连续进样6次，测得4-磺酰胺基苯肼和磺胺峰面积的RSD分别为2.55 %和2.03 %，结果表明仪器精密度良好。

2.2.6.2 重复性试验 精密称取二芳基吡唑类衍生物约20 mg，置10 ml量瓶中，加回收率储备液1 ml，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，作为重复性样品溶液。另取2.1.3项下对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各杂质的含量。结果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD为3.64 %（n=6），磺胺含量的RSD为0.69 %（n=6），表明重复性良好。

2.2.6.3 中间精密度 不同人员配制6份重复性样品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各杂质的含量。结果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD为3.90 %（n=12），磺胺含量的RSD为4.78 %（n=12），表明中间精密度良好。

2.2.7 样品的测定 取二芳基吡唑类衍生物，按2.1.3项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件，量取对照品溶液和供试品溶液各5 μl，注入液质联用色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算各供试品溶液中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量。结果多批二芳基吡唑类衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺均低于定量限。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

二芳基吡唑类衍生物在甲醇中溶解性较好，磺胺和4-磺酰胺基苯肼微溶于甲醇，考虑主成分浓度较大，杂质浓度较小，最终确定以甲醇作为溶剂。

3.2 色谱柱的选择

为了提高杂质检测的灵敏度，本研究选用质谱检测器进行检测。由于较高浓度的样品溶液可能会对质谱检测器造成污染，建立的色谱方法应能实现杂质与主成分峰的很好分离，以便于通过切换阀实现主成分峰不进入质谱检测器。分析磺胺、4-磺酰胺基苯肼和二芳基吡唑类衍生物结构，前两者含1个苯环，后者含2个苯环，试验结果表明对于芳香化合物有特殊选择性的苯基柱可实现磺胺、4-磺酰胺基苯肼与二芳基吡唑类衍生物的较好分离，因此选用苯基柱进行研究。

3.3 流动相的选择

质谱检测器需使用挥发性流动相添加剂，为了优化峰形，使目标物之间、目标物与溶剂峰之间能较好分离，经过试验，使用醋酸铵作为流动相添加剂，调整pH值为4.0，能使磺胺和4-磺酰胺基苯肼实现基线分离。通过调整有机相比例和梯度洗脱，使二芳基吡唑类衍生物出峰时间在5 min之后，切换阀控制主峰不流入质谱，同时确保每次样品测定时主峰能被完全洗脱不影响下一针样品检测。

3.4 限度的确定

本文中二芳基吡唑类衍生物以塞来昔布为模型化合物设计合成，杂质控制限度参考塞来昔布最大日剂量600 mg，按遗传毒性杂质要求进行严控。根据毒理学关注阈值（TTC）1.5 μg/d计算，设定4-磺酰氨基苯肼和磺胺含量均不得过0.00025 %。