桑叶药材芦丁含量及其质量评价研究

邓李红，吴晓英，汪 梅，林伟雄，罗 毓，邓 韬，孙冬梅*，陈仕妍

（1.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；2.广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

桑叶为桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥叶，是我国首批认定的药食同源中药材品种[1]，最早记载于《神农本草经》，被列为中品，药用始载于《五十二病方》[2]，性味甘、苦、寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效，多用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花等症[3]。桑叶资源丰富，在我国东北、西南、西北各省区均有栽培，中亚各国、欧洲、印度等地亦有栽培[1,4]。现代文献研究表明，桑叶中主要含黄酮类、酚酸类、生物碱类、香豆素类、氨基酸类、多糖类等多种化学成分，其中黄酮类、生物碱类、多糖类化合物为桑叶的主要药效成分[1,5-8]，具有降血糖、调血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用[9-14]。《中国药典》2020年版桑叶含量测定项下仅规定了单指标成分芦丁的含量限度要求[3]，但桑叶作为多个化学成分的复合体，其多种成分都有明确的药理活性报道[1]。高效液相（HPLC）指纹或特征图谱则能较全面系统地反映桑叶整体化学成分的特征信息，因此采用含量测定和特征图谱相结合的综合评价方法更能体现桑叶药材的内在质量。故本研究在测定芦丁含量的基础上，建立桑叶药材HPLC特征图谱，通过化学计量学分析方法、AHP层次分析法、CRITIC客观权重赋值法及AHP-CRITIC复合加权法对特征图谱多指标变量进行统计分析，结合Person相关系数法分析芦丁含量与桑叶药材色度值的相关关系，综合评价34批桑叶药材质量，以期为桑叶的质量控制提供新的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ARC型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E型万分之一天平，XP26百万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MiliQ Direct 8型超纯水机（德国Merck）；111B型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 材料

新绿原酸对照品（质量分数99.58 %，批号：DSTDX001503），隐绿原酸对照品（质量分数99.30 %，批号：DST220104-035），芦丁对照品（质量分数99.19 %，批号：DST210520-017），均购自成都乐美天医药科技有限公司；液相用甲醇，磷酸为色谱级，其他试剂为分析纯，水为超纯水。34批桑叶药材（编号：S1～S34）经广东一方制药有限公司孙冬梅教授鉴定为桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥叶，来源信息详见表1。

表1 34批桑叶药材来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.1 %磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，15 %A；5～20 min，15 %A～30 %A；20～40 min，30 %A～60 %A；40～42 min，60 %A～15 %A；42～47 min，15 %A）；柱温30 ℃；检测波长358 nm；体积流量1.0 ml/min；进样体积10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

取新绿原酸、隐绿原酸和芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成含新绿原酸39.04 μg/ml、隐绿原酸24.83 μg/ml和芦丁22.42 μg/ml的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇10 ml，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）45 min，取出放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取桑叶供试品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，以6号芦丁峰为参照峰（S），计算得到各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.00 %～0.09 %，0.21 %～1.39 %，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取桑叶供试品粉末适量，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以6号芦丁峰为参照峰（S），计算得到各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.00 %～0.11 %，0.27 %～1.09 %，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取桑叶供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h，按2.1项下色谱条件进样测定，以6号芦丁峰为参照峰（S），计算得到各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.00 %～0.17 %，0.27 %～2.99 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 HPLC特征图谱的建立及相似度评价

取34批桑叶样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件对色谱图进行匹配，以S1图谱作为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，通过多点校正、全谱峰匹配生成34批桑叶的共有特征图谱，同时采用中位数法生成对照特征图谱，34批桑叶共有特征图谱中共标定了7个共有峰，桑叶共有特征图谱及对照特征图谱（R）详见图1。计算34批次桑叶HPLC特征图谱与生成的共有对照特征图谱的相似度，均大于0.90，见表2，表明不同批次桑叶样品间质量一致性较好。通过将对照特征图谱与对照品图谱比对，确定1号峰为新绿原酸，3号峰为隐绿原酸，6号峰为芦丁，见图2。

图1 34批桑叶共有特征图谱及对照特征图谱

图2 混合对照品色谱图

2.6 聚类分析

聚类分析是一种无监督模式识别方法，将34批桑叶特征图谱中7个共有特征峰单位峰面积输入SIMCA（14.0）软件中进行聚类分析，见图3。结果显示，聚类分析将34批桑叶样品分成了3大类，其中S1～S3、S6～S10、S12、S16～S18、S22～S24号样品聚为第1类，S4～S5、S14、S19～S21、S28、S31、S33号样品聚为第2类，S11、S13、S15、S25～S27、S29～S30、S32、S34号样品聚为第3类。该分类结果可初步确定34批桑叶样品成分组成具有一定的差异，相同产地的药材不一定能聚为一类。

图3 34批桑叶样品聚类分析树状图

2.7 主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

在聚类分析的基础上，进一步采用PCA对34批桑叶样品进行比较，以特征值>1为标准，提取出2个主成分，可用于反映34批桑叶样品HPLC特征图谱77.54 %以上信息，其中PC1贡献率为55.27 %，贡献率最大，PC2贡献率为22.27 %，详见表3。由前2个主成分建立坐标系，得到34批桑叶样品的PCA得分图（详见图4），由图4可见，34批桑叶样品可较分散地聚为3类，与聚类分析结果一致，同样表明不同产地不同批次的桑叶样品间化学成分均具有一定差异。根据桑叶共有峰成分矩阵，主成分1的信息来自峰2～7，其中3号峰为隐绿原酸、6号峰为芦丁；主成分2的信息来自峰1，其中1号峰为新绿原酸，详见表4。

图4 34批桑叶样品的PCA得分图

表3 特征值和累积方差贡献率

表4 桑叶药材成分矩阵

为进一步明确上述3类桑叶样品之间产生差异的主要标志物，基于PCA结果，采用监督模式识别法进行桑叶样品间OPLS-DA分析，绘制OPLS-DA模型得分图，详见图5。OPLS-DA模型的拟合参数R2X=0.775，R2Y=0.694，预测参数（Q2）=0.624，均大于0.5，表明所建模型稳定且预测能力较强。以模型变量投影（VIP）值>1为标准，得到色谱峰3（隐绿原酸）、峰5、峰1（新绿原酸）、峰7的VIP值分别为1.13，1.10，1.05，1.03，可作为区分桑叶质量差异的标志物，详见图6。

图5 34批桑叶样品的OPLS-DA得分图

图6 34批桑叶样品7个共有峰的VIP值

2.8 AHP-CRITIC法分析

2.8.1 AHP法计算权重系数 桑叶主要成分为黄酮类、生物碱类及多糖类，药理活性研究表明这些成分具有降血糖、调血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒作用[1,7]，但不同成分的药理作用强弱存在差异，将桑叶特征图谱的7个共有峰的单位峰面积予以量化，分成3个层次，确定各指标的优先顺序为药典指标成分[3]峰6（芦丁）优于已知峰1，3（新绿原酸、隐绿原酸），优于未知峰2，4，5，7，依次构建成对比较的判断优先矩阵，并分别赋予各项指标相对评分为1，2，3分，见表5。

表5 指标成对比较判断优先矩阵

采用和法求解[15]峰6（芦丁）、峰1（新绿原酸）、峰3（隐绿原酸）、峰2、4、5、7的权重系数分别为0.2935，0.1730，0.1730，0.0901，0.0901，0.0901，0.0901。计算权重，结果见表6。

2.8.2 CRITIC法计算权重系数 CRITIC法[16]是一种以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础综合衡量的客观权重计算方法。计算权重，结果见表6。

2.8.3 AHP-CRITIC复合加权法计算权重系数 AHP法主观评价了指标两两比较判断的优先信息，而CRITIC法利用样本数据的客观性评价了相应指标的权重系数，再对两组权重数据进行组合，计算混合权重水平，结果见表6。

分别用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加权法计算得到的权重系数，对试验结果进行综合评分比较。相关系数分析结果显示，AHP法和CRITIC法的相关系数为0.984，AHP法和复合加权法的相关系数为0.999，CRITIC法和复合加权法的相关系数为0.988，三者相关性有统计学意义（P＜0.01），表明3种方法的评分结果具有一致性。结合聚类分析和PCA结果知，分为第1类的桑叶样品，三者的评分结果均低于42分，分为第2、3类的桑叶样品，三者的评分结果数值有部分交叉，但均高于42分，且从聚类分析结果看第2、3类的桑叶样品仍可聚为一大类，推测第2、3类的桑叶样品品质优于第1类的桑叶样品，可为桑叶药材的质量评分提供参考。

3 含量方法与结果

3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱，以甲醇为流动相A，0.5 %磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，30 %A；5～10 min，30 %A～35 %A；10～15 min，35 %A～40 %A；15～18 min，40 %A～50 %A；18～19 min，50 %A～30 %A；19～30 min，30 %A）；检测波长为358 nm。

3.2 对照品溶液的制备

取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，称定重量，加热回流1.0 h，取出放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.4 线性关系考察

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 ml含199.54 μg的对照品储备液，分别取0.2，0.4，1，2，5，10 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，得系列对照品溶液，按3.1项下色谱条件进样分析。以进样质量浓度X（μg/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=23 125.78X+23 301.15，相关系数（R2）为0.9992，表明在3.99～199.54 μg/ml范围内线性关系良好。

3.5 精密度试验

精密称取桑叶样品，按3.3项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，芦丁峰面积的RSD为0.99 %（n=6），表明仪器精密度良好。

3.6 重复性试验

精密称取桑叶样品6份，按3.3项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦丁含量的RSD为0.64 %（n=6），表明该方法重复性良好。

3.7 稳定性试验

精密称取桑叶样品，按3.3项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0，2，4，8，12，24 h，按3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦丁峰面积的RSD为0.20 %（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.8 加样回收试验

精密称取含量已知的桑叶样品0.25 g，置具塞锥形瓶中，按样品中芦丁含量的50 %，100 %和150 %分别加入相应对照品，设计3组实验，每组平行3份。按3.3项下方法制备供试溶液，按3.1项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表7。

表7 芦丁的加样回收试验结果（n=9）

3.9 样品测定

取34批桑叶样品，按3.3项下方法制备供试品溶液，再按3.1项色谱条件进样测定，计算各成分含量，结果见表8。

表8 34批桑叶芦丁含量和色度值结果

3.10 桑叶芦丁含量与色度值相关性分析

取34批桑叶粉末适量，压制于分光测色仪载玻片上，压制厚度约为1 mm。采用光源D65，设置标准观察角10°，照明口径50 mm，扫描速度600 nm/min，狭缝宽度1 nm，经标准白板校正后，平行测定3次取平均值，记录色度值L（表示明度）、a（红-绿轴）、b（黄-蓝轴），计算样品总色值E=（L2+a2+b2）/2，见表8。

采用SPSS 20.0软件对34批桑叶的色度值L、a、b、E与芦丁含量进行Person相关性分析，结果显示芦丁含量与L、a、b、E的相关性分别为0.360（P<0.05），-0.234，0.396（P<0.05），-0.297，即芦丁含量与桑叶色度值L、b值有显著正相关关系，其中L值越大，表示越亮，反之越暗，b值越大，黄色越明显，反之蓝色越明显，表明偏亮黄色的桑叶芦丁含量较高。

4 讨论

本研究考察了提取溶剂（甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇、30 %甲醇、50 %乙醇、70 %乙醇），提取方式（超声，回流），提取溶剂用量（25，50，100 ml），提取时间（0.5，1.0，2.0 h）等供试品制备条件对指标成分芦丁含量测定的影响，最终选择了加入70 %甲醇50 ml，回流提取1.0 h作为芦丁含量测定的供试品溶液制备方法，可确保芦丁成分最大程度地被提取测定，且检测出的芦丁峰形较好，分离度较高。另考察了提取溶剂，提取方式，提取溶剂用量，提取时间等供试品制备条件对特征图谱各指标测定的影响，优选了加入50 %甲醇10 ml，超声提取45 min的特征图谱供试品制备条件，得到的特征图谱各色谱峰能满足分析要求。

本研究将34批桑叶样品特征图谱的7个共有特征峰进行无监督模式聚类分析和PCA分析，其分析结果均将34批桑叶样品大致区分为三大类，且相同产地的桑叶药材不一定能聚为一类，进一步通过监督模式识别法进行OPLS-DA分析，筛选得到4个引起桑叶样品间成分差异的主要标志性成分，表明不同产地或相同产地的桑叶药材质量差异是多种成分共同作用的结果。分别用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加权法计算得到34批桑叶的7个共有特征峰的权重系数，对试验结果进行综合评分比较得知，聚类分析归为第1类的样品综合评分全低于42分，而综合评分高于42分的样品则全为聚类分析纳为第2、3类的样品，其芦丁含量也均高于0.25 %，且从聚类分析结果看第2、3类的桑叶样品仍可聚为一大类，推测第2、3类的桑叶样品品质优于第1类的桑叶样品，可为桑叶药材的质量评分提供参考。由桑叶芦丁含量与色度值的相关性结果知，芦丁含量与色度值L、b值有显著正相关关系，表明偏亮黄色的桑叶芦丁含量较高，可能桑叶不同生育周期下对次生代谢产物芦丁的积累产生影响，从而导致桑叶药材芦丁含量的差异，也可能与桑叶地理环境、气候条件、采收时间和干燥方式等有关[17]。

本研究通过测定桑叶特征图谱、芦丁含量和色度值，结合化学计量学分析方法、AHP层次分析法、CRITIC客观权重赋值法及AHP-CRITIC复合加权法对桑叶药材进行定量和一致性评价研究，直观评价桑叶药材品质的一致性和化学成分的差异性，可为桑叶药材的质量控制和相关产品开发提供科学参考。