布鲁氏菌耐药性与耐药机制研究进展

任 静,黎圣洪

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性嗜氧菌,属兼性细胞内寄生菌,它引起的布鲁氏菌病是一种人兽共患病,畜类布鲁氏菌病主要症状为母畜流产、公畜睾丸炎,人类感染布鲁氏菌主要表现为长期反复的波状热、乏力、多汗、肌肉和关节疼痛等。自1887年首次从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离到布鲁氏菌以来[1],经100多年的研究,共有12种布鲁氏菌被发现[2]。目前布鲁氏菌病仍是中国主要的公共卫生问题之一[3],根据我国疾病预防控制局(http://www.nhc.gov.cn)发布的数据显示,2017-2021年中国人间布鲁氏菌病的发病率分别是2.79/10万、2.73/10万、3.15/10万、3.36/10万、4.91/10万,整体呈现上升趋势,发病率的上升给我国公共卫生、畜牧业、社会经济发展带来负担。人布鲁氏菌病的一线治疗方案是多西环素联合利福平或链霉素,效果不理想或存在禁忌时,可采用多西环素与复方新诺明或妥布霉素联合用药,或喹诺酮类联合利福平作为二线治疗方案[4]。但随着抗菌药物的使用,布鲁氏菌出现耐药,给临床治疗带来挑战,因此了解其耐药性和机制对改善患者预后极其重要。

分析2013-2022年有关动物源、人源布鲁氏菌耐药性研究的文献及数据发现:动物源布鲁氏菌监测的动物对象以牛、羊为主,极少数篇目未注明布鲁氏菌种类[5],大多数篇目都是关于羊种、牛种布鲁氏菌;人源布鲁氏菌的种类绝大多数是羊种。本文就2013-2022年发表的关于牛羊源布鲁氏菌(主要为羊、牛种)和人源布鲁氏菌(主要为羊种)耐药性与耐药机制研究进展作一综述。

1 不同来源的布鲁氏菌耐药性

1.1 来自牛羊的菌株 通过分析近10年发表的牛源、羊源布鲁氏菌耐药监测结果(表1)发现,全球多地牛羊源布鲁氏菌耐药现象都较为严重,南非甚至出现耐药性强、耐药谱广的现象,对利福平、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、红霉素的耐药率甚至达到100%,这可能和上述药物在当地使用时间较长,应用范围较广有关。对多西环素、四环素的耐药情况各地区有差异,埃及、中国新疆、伊朗德黑兰的牛羊源布鲁氏菌以及土耳其羊源布鲁氏菌对四环素的耐药率小于30%,中国新疆、伊朗德黑兰、吉尔吉斯斯坦牛羊源布鲁氏菌对多西环素的耐药率小于30%,而南非牛羊源布鲁氏菌对多西环素耐药率大于70%,对四环素耐药率大于30%,且南非、埃及、土耳其牛羊源布鲁氏菌均存在多药耐药的情况。

表1 牛源、羊源布鲁氏菌的耐药性

Manafe等[5]收集南非地区牛、山羊、绵羊源的123株布鲁氏菌进行耐药分析,发现牛羊源布鲁氏菌对利福平、阿莫西林、多西环素、四环素、青霉素G、头孢克肟、红霉素的耐药趋势大致相同,总体耐药情况都比较严峻。对于复方新诺明、头孢西丁牛源的耐药水平明显高于羊源。这种现象表明,同一地区不同种类动物宿主所分离得到的布鲁氏菌药物敏感性各不相同,可能是由于不同动物使用抗菌药物种类和剂量不同所致。

Khan等[11]埃及的研究人员对收集自牛、羊的29株布鲁氏菌进行了药敏检测,结果显示羊种布鲁氏菌(21株)环丙沙星、红霉素、亚胺培南、利福平的耐药率为76.2%、19%、76.2%、76.2%,而牛种布鲁氏菌(8株)对环丙沙星、红霉素、亚胺培南、利福平的耐药率为25%、87.5%、25%、37.5%,提示同一地区不同种布鲁氏菌的抗菌素耐药率有显著差异,该研究团队在所有利福平耐药株中均检测出利福平抗性基因(rpoB)突变,在4株羊种布鲁氏菌的环丙沙星耐药株中检测出gyrA和gyrB基因的喹诺酮耐药区点突变。

1.2 来自临床的菌株 在布鲁氏菌病治疗中,布鲁氏菌耐药性检测具有重要意义,但由于具备操作布鲁氏菌的三级生物安全实验室单位少,所以布鲁氏菌耐药检测开展少。1986年Jurica等[12]首次报告了多西环素、利福平双联治疗羊种布鲁氏菌患者期间出现利福平耐药,该团队从患者首次治疗前的血培养中分离出的布鲁氏菌对6种抗生素都敏感(利福平MIC=1.0 mg/L),使用双联抗感染6周后停药。在停药3个月后,患者再次出现关节痛症状,此次血培养分离出的布鲁氏菌对利福平耐药(MIC=64 mg/L),后用多西环素联合奈替米星联合治愈了该患者。

通过分析人源布鲁氏菌的耐药性(表2),对比牛羊源、人源布鲁氏菌的耐药性,发现后者耐药性明显减弱,对于抗菌药物的耐药率多小于30%。人源布鲁氏菌对利福平的敏感性减弱是世界范围普遍存在的问题,这与利福平作为人间布鲁氏菌病的一线用药广泛运用有关,但对利福平的耐药率各地差异明显。我国玉溪、内蒙乌兰察布、内蒙兴安盟、伊朗地区人源布鲁氏菌对利福平的耐药率小于3%,而哈萨克斯坦人源布鲁氏菌对利福平的耐药率高达26.4%。

表2 人源布鲁氏菌的耐药性

我国人源布鲁氏菌除发现存在对利福平耐药的菌株外,还发现对复方新诺明耐药的现象。刘志国等[19]另外对我国各地149株羊种布鲁氏菌在体外对利福平和复方新诺明的敏感性进行了筛查,结果显示有4株对利福平表现为中介敏感,而对复方新诺明的耐药率高达25.5%(38/149)。另外,多篇来自内蒙古地区的研究提示,该地区人源羊种布鲁氏菌对阿奇霉素的耐药率达到100%[18-20],建议临床上停止使用。

Irajian等[9]检测伊朗德黑兰人源布鲁氏菌的耐药情况,发现该地区人源布鲁氏菌存在对四环素、庆大霉素、复方新诺明耐药。而对伊朗马哈丹、卡珊地区的人源布鲁氏菌耐药检测却未发现耐药布鲁氏菌株。提示同一国家不同地区人源布鲁氏菌药物敏感性各不相同。

这些布鲁氏菌株抗药性各不相同,可能是由于各国医疗卫生情况和各国抗菌药物使用水平不同导致,但也有学者提出实验方法的不同会导致实验结果的差别,Johansen等[24]从1991-2016年在挪威各地收集到来自临床的23株羊种布鲁氏菌,采用微量肉汤稀释法(microdilution method)的药敏结果提示有17株对利福平的敏感性降低,6株对利福平耐药,而采用梯度条带法(gradient strip method)的药敏结果则显示只有4株对利福平的敏感性降低,其余19株均对利福平敏感。在对上述菌株的耐药基因检测中发现了利福平抗性基因(rpoB)的突变,但rpoB突变与体外药敏试验结果并不相符。波黑地区的学者对临床的108株羊种布鲁氏菌分别使用布鲁氏肉汤、阳离子调节MH肉汤(加4%裂解马血)、阳离子调节MH肉汤(加5%脱纤维棉羊血)培养后进行药敏试验,结果显示使用布鲁氏肉汤组91株(84.3%)对复方新诺明耐药,而阳离子调节MH肉汤的两组均无对复方新诺明耐药,但大于90%的布鲁氏菌在各个组别均对阿奇霉素耐药[25]。不同实验方法导致实验结果的差异,应结合临床用药疗效予以鉴别。不同区域菌株敏感性的数据对指导当地临床治疗更有实际意义,在临床用药中应予以考虑和重视。

2 布鲁氏菌的耐药机制研究现状

2.1 利福平耐药机制研究现状 利福平属于利福霉素类广谱抗生素,它作用于细菌RNA聚合酶的β亚基,可抑制聚合酶活性,使细菌无法转录出完整的RNA而死亡。细菌对利福平的耐药获得主要通过:β亚基的编码基因-rpoB基因突变导致β亚基对利福平的亲和力降低、对药物的修饰灭活、膜通过性改变、外排泵等方式使细菌耐药[26]。对羊和牛种布鲁氏菌的研究表明rpoB基因存在影响利福平抗性水平的高变位点(1560-1740位点)[27]。杨晓雯等[28]在利福平浓度逐渐增高的情况下通过对羊布鲁氏菌进行连续传代,获得了对利福平具有高水平耐药性的羊布鲁氏菌耐药菌株。他们的研究结果显示耐药菌株rpoB基因1606位点由C变为T,这与前人研究类似[27],该研究还发现利福平耐药菌株中virB操纵子表达下调,virB操纵子编码的virB1-12蛋白与细菌在细胞内复制和形成持续性感染有关[29],而耐药株通过降低virB操纵子基因的表达来抵御利福平的作用。杨晓雯等[30]又进一步构建了virB基因缺失的羊布鲁氏菌株,采用布鲁氏菌肉汤培养基观测不同利福平浓度下基因缺失株和亲本株的生长特性。3 d后virB7-11基因缺失株的利福平MIC值高于亲本株,而virB1-6、virB12基因缺失突变株MIC值与亲本株无差异,进一步证实了virB7-11在羊布鲁氏菌对利福平耐药中起重要作用。

2.2 氟喹诺酮类耐药机制研究现状 氟喹诺酮类药物主要通过抑制细菌DNA拓扑异构酶来干扰细菌DNA复制,从而起到抑制细菌增殖生长的作用。细菌DNA拓扑异构酶有I、II、III、IV四种,其中拓扑异构酶II又称为DNA回旋酶。喹诺酮类药物耐药主要通过:DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶IV突变、外排泵以及质粒介导的喹诺酮耐药[31]。Turkmania等[32]通过体外实验观察到耐药牛种、羊种布鲁氏菌在加入多重耐药泵抑制剂羰基氰化物间苯腙(CCCP)后,细胞内氟喹诺酮含量增加,推测布鲁氏菌对氟喹诺酮耐药有外排泵的参与。Turkmania等[33]还通过PCR技术对获得的耐药牛、羊种布鲁氏菌株进行DNA回旋酶编码基因gyrA和DNA拓扑异构酶IV编码基因parC进行检测,结果发现对左氧氟沙星耐药的羊种布鲁氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Asn(AAT)突变,对环丙沙星耐药的羊种布鲁氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Tyr(TAT)突变,对氧氟沙星耐药的牛种布鲁氏菌gyrA基因存在Ala(GCT)87→Val(GGT)突变,而在partC基因上未检测到突变。Elisa等[34]在巨噬细胞模型中观察羊种布鲁氏菌对氟喹诺酮类药物耐药实验过程中发现,羊种布鲁氏菌出现对氟喹诺酮类药物耐药与gyrA位点发生突变有关,耐药株gyrA的第260位点均发生C→T突变,导致Ala(GCT)87→Val(GTT)改变,但这些突变株与野生非突变株相比,感染新巨噬细胞的能力和喹诺酮类药物再次暴露后在巨噬细胞内的生存能力无增强。

2.3 磺胺类耐药机制研究现状 磺胺类药物主要通过与氨基苯甲酸(PABA)竞争二氢叶酸合成酶,阻止细菌二氢叶酸(FH2)合成进而阻止四氢叶酸(FH4)合成,使DNA前体物质嘌呤和嘧啶无法合成抑制细菌生长繁殖,细菌对磺胺类的耐药性可通过:二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶的sul和dfrA基因突变[35]、二氢喋呤还原酶和二氢叶酸还原酶的folA和folP基因突变[36]、SmeVWX和SmeDEF外排泵的调节基因突变[37]产生。Johansen等[24]在23株布鲁氏菌的耐药基因检测中发现与甲氧苄氨嘧啶耐药相关基因folA和folP突变,但上述菌株的体外药敏实验对复方新诺明并不耐药。

2.4 氨基糖苷类耐药机制研究现状 氨基糖苷类药物经膜孔通道被动扩散穿过细菌细胞外膜,再经氧依赖行主动跨膜转运系统进入细胞内,特异性与核糖体30s亚基16sRNA的高保守位点结合进而抑制细菌蛋白合成[38],现有的研究已经证明细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制主要包括氨基糖苷类修饰酶的修饰作用[39]、细菌靶位突变[40]和药物的摄取减少[41]等。我国学者杨晓雯等[38]从喜马拉雅旱獭体内分离出一株耐阿米卡星的牛种布鲁氏菌(MIC≥512 mg/L),对其进行基因分析,结果发现该阿米卡星耐药株具有编码氨基糖苷3′-磷酸转移酶的阿米卡星耐药基因(aph(3′)-IIa),并通过构建质粒的方式推测出可能是通过T3家族转座子从沙门氏菌获得,该耐药基因可编码氨基糖苷类抗生素修饰酶,通过修饰酶对氨基糖苷类抗生素进行修饰,使其无法作用于细菌而产生耐药性。

2.5 大环内酯类耐药机制研究现状 大环内酯类药物主要通过抑制细菌蛋白合成,从而达到抗菌的目的[42]。细菌核糖体23S rRNA基因的单位点突变使大环内脂类抗菌药物与核糖体亲和性下降,从而产生耐药性[43],刘志国等[19]对85株阿奇霉素耐药的羊种布鲁氏菌进行耐药基因测序,结果发现所有耐药菌株的23S rRNA基因的2 632位碱基出现T→C单位点突变,提示布鲁氏菌23S rRNA转肽酶中心的T/C点突变可能是一种羊种布鲁氏菌对阿奇霉素耐药的分子机制。

目前国内外对布鲁氏菌耐药机制的研究较少,尤其缺少布鲁氏菌对β-内酰胺类、四环素类药物耐药机制的研究。

3 结 语

布鲁氏菌的耐药性、耐药机制和耐药基因携带情况是目前的研究热点。中国布鲁氏菌病发病率高,近年来也出现了关于利福平、复方新诺明等药物耐药菌株的报道。细菌耐药监测是掌握细菌耐药性的手段,是临床合理选择抗菌药物的数据支持,但目前布鲁氏菌耐药监测覆盖面不全,监测到的耐药率仅反应参加监测的区域耐药情况,应扩大监测覆盖区域。利用基因检测技术检测标本中耐药基因的变化,将更多布鲁氏菌耐药基因纳入到现有基因组数据库,有助于了解布鲁氏菌耐药基因在布鲁氏菌病流行规律中的作用;另一方面,通过观察患者体内布鲁氏菌对特定药物的耐药基因突变,可了解国内不同区域耐药菌株的流行特点及趋势,对有效防治耐药菌株具有重要意义。

利益冲突：无