人用狂犬病疫苗及其应用研究进展

随海田,郭 星,张 倩,杨中楠,苏锦锋,张 杨,殷文武,舒 祥

狂犬病是世界上最致命的人兽共患病之一,流行于全球150多个国家,每年造成约59 000人死亡,其中95%的病例发生在亚洲和非洲[1],80%发生在农村地区[2]。狂犬病流行病学负担约370万伤残调整寿命年(disability-adjusted life year,DALY)[3],经济损失高达86亿美元[4]。虽然狂犬病在出现临床症状后病死率接近100%,但它却是一种疫苗可预防疾病。提供经济实惠、优质的疫苗是实现狂犬病零死亡的关键所在。因此,了解目前人用狂犬病疫苗应用方面的最新研究进展,有利于更好地制定狂犬病综合防控策略,促进人类健康。

1 人用狂犬病疫苗发展简史

1885年,路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)和埃米尔·鲁克斯(Emile Roux)研发并测试了第一种可注射的狂犬病减毒活疫苗,该疫苗由兔神经组织制成。然而,神经组织疫苗可能导致严重的不良事件[3]。20世纪50年代后发展了禽胚培养疫苗,与前代相比不良反应率仍较高,无优越性,且免疫保护效果不理想,未得到推广[1]。为了提高狂犬病疫苗的效果、优化免疫程序和降低异常反应发生率,1960年后,研究者开始尝试用细胞培养技术来研发狂犬病疫苗[5]。1965年Wiktor和Koprowski研发了第一种人二倍体细胞狂犬病疫苗(human diploid cell vaccine,HDCV)[6]。1976年,HDCV首先在欧洲获得批准用于暴露前和暴露后免疫,1978年开始商品化[5]。HDCV在欧洲及北美应用40多年,是目前国际公认的金标准狂犬病疫苗,常作为新研发狂犬病疫苗的标准对照疫苗[7]。1985年人们研制出纯化鸡胚细胞疫苗(purified chicken embryo cell vaccine,PCECV)和纯化Vero细胞狂犬病疫苗(purified Vero cell rabies vaccine,PVRV)[6]。由于PVRV产量高、价格低、免疫效果好,1987年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)颁发了Vero细胞生产人用纯化狂犬病灭活疫苗规程,推荐使用Vero细胞生产的狂犬病疫苗。目前PVRV在全世界范围都有使用,也是国内产量最大,应用最广泛的人用狂犬病疫苗[5]。1980年以前,我国一直生产和使用羊脑制备的经石碳酸灭活的脑组织疫苗。1965年,我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗,此疫苗需加入氢氧化铝作为佐剂以增加疫苗效力,1980年获生产许可证书。由于疫苗效价较低且免疫失败病例频发,卫生部决定改进疫苗生产工艺。经浓缩疫苗以及引入柱层析等纯化技术去除蛋白质杂质等手段,达到了WHO设定的疫苗有效标准。然而添加氢氧化铝佐剂会导致机体免疫应答缓慢,产生中和抗体延迟,因此,2005年,国家食品药品监督管理局要求去除氢氧化铝佐剂[8]。1990年以来,我国开始引进和研制PVRV疫苗。2002年辽宁成大生物股份有限公司引进微载体生物反应器细胞培养技术,利用狂犬病病毒PV2061疫苗株和Vero细胞研发PVRV,并于2005年获得国家药监局批准使用。目前,该公司人用狂犬病疫苗年产能达1 000万人份,主要出口到泰国、菲律宾和埃及等一带一路国家[9]。我国自2004年开始研制HDCV疫苗,2014年国产HDCV批准上市,采用了生物反应器微载体培养技术、超滤浓缩和层析纯化技术,疫苗质量指标突出,免疫原性和安全性良好,改变了我国没有金标准狂犬病疫苗的局面[5]。

2 人用狂犬病疫苗免疫策略

人用狂犬病疫苗最初全程免疫需接种14针,亦有23针法。伴随疫苗制备技术的发展,狂犬病疫苗的免疫原性明显提高。经过临床验证的不同免疫针次和间隔时间的抗体应答比较,免疫程序逐步简化。与此同时,随着疫苗纯度的提高,接种后不良反应明显降低,免疫针次逐渐减少。欧洲率先采用6针法,第0 d、3 d、7 d、14 d、28 d、90 d各注射1剂狂犬病疫苗。随着临床研究数据的积累发现与第5剂比较,第6剂接种后并不能使受种者抗体水平显著提高。因此,修订为一般情况下仅需要接种5针,根据接种者情况决定是否接种第6针[10]。之后,5针法(Essen方案)被WHO推荐并在全球广泛应用。1980年代,4针法(Zagreb方案)正式形成,并于1992年获得WHO推荐。2008年,美国免疫实施咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices,ACIP)通过循证医学总结评估,支持推行简化4针法(在原5针法基础上取消最后1剂接种)。次年,经过ACIP的审核和评论,建议健康成年人在暴露后规范处置的情况下,可采取简化4针法免疫程序[8]。2010年,WHO针对狂犬病暴露后肌肉注射免疫程序除 Essen和Zagreb方案外,推荐使用简化4针法。2018年,WHO继续推荐简化4针法免疫程序,推荐暴露后免疫程序为Zagreb方案和简化4针法。同时,简化4针法免疫接种时间从0 d、3 d、7 d、14 d改为0 d、3 d、7 d、14 d～28 d。Essen程序仍然可以使用[10]。2019年,中国《狂犬病暴露预防处置专家共识》推荐的狂犬病暴露后肌肉注射免疫程序为Essen、Zagreb和简化4针法3种方案[11]。相信随着疫苗研发和生产技术的不断进步,狂犬病疫苗免疫原性逐渐提高,以及对免疫机制的深入研究,免疫程序将进一步优化。

狂犬病可通过接种疫苗进行预防,我国作为全球狂犬病疫苗的生产和使用大国,接种费用较高,经济负担巨大。因此采用具有成本效益和剂次节约的高效疫苗或简化疫苗免疫程序成为发展趋势。接受WHO最新建议将使狂犬病暴露患者以更加经济的方式更多地获得免疫预防。然而,目前国内尚缺乏有关简化程序与标准程序的比较研究。虽于2019年在《狂犬病暴露预防处置专家共识》中对简化4针法进行了推荐,但国内尚无狂犬病疫苗采用简化4针法,亦未开展狂犬病疫苗简化4针法相关临床试验。我国须根据国内疫情、疫苗供应等条件积极进行疫苗效果评价,为优化程序的免疫实施推广提供理论依据。

3 人用狂犬病疫苗研究现状

3.1 安全性 国内何颖等使用冻干人用PVRV在小鼠模型上进行了我国现行狂犬病疫苗暴露前免疫程序与WHO推荐免疫程序的比较研究,结果显示,实验期间各免疫组与对照组小鼠均无死亡,注射部位无水肿;食欲正常,生长发育良好,精神活泼反应灵敏,皮毛正常有光泽,尿液正常清亮,粪便颜色呈灰褐色颗粒,各免疫组小鼠生存率均为100%[12]。最新一项随机II期暴露前预防研究对无血清PVRV在健康成年人中的安全性进行了评估,并与HDCV进行了比较,研究期间均未观察到与疫苗接种相关的严重不良事件[13]。两组受试者在初次和加强疫苗接种后不良反应的发生率、持续时间和严重程度方面均相似,最常见的不良反应为注射部位不良反应,注射部位疼痛多为1级严重程度,且于3 d后缓解,全身不良反应症状均可自行缓解或药物治疗后缓解[13]。

一项大型系统综述和荟萃分析[14]纳入27项研究共18 630名受试者,比较了不同疫苗的暴露后预防安全性。分析显示,HDCV不良反应发生率为3.2%(95%CI:0.9%～10.9%),PVRV为11.7%(95%CI:5.2%～24.1%),PCECV为26.0%(95%CI:16.4%～38.7%)。HDCV总不良反应发生率显著低于PCECV。与PVRV和PCECV相比,HDCV引起的局部疼痛和发热的发生率较低。PVRV与PCECV的局部和全身不良反应发生率无显著差异。对中国地区狂犬病暴露后的普通人群全程接种狂犬病疫苗后不良反应发生率进行Meta分析[15],检索时限为2000年1月至2016年7月,共纳入29篇文献,总调查人数为94 222人,不良反应发生率为1.04%～47.78%。国产疫苗与进口疫苗不良反应率差异无统计学意义。

3.2 免疫原性 2020年一项大型系统评价和meta分析[16]纳入80项研究共12 413名受试者,对主要来自泰国、美国、印度和法国的暴露前免疫预防研究(涉及HDCV、PCECV和PVRV 3种狂犬病疫苗共14种不同的免疫程序)和主要来自泰国、印度和中国等亚洲国家的暴露后免疫预防研究(涉及HDCV、PCECV、纯化鸭胚细胞疫苗和PVRV 4种狂犬病疫苗共25种不同的免疫程序)进行了分析。结果表明,无论是皮内注射还是肌肉注射,狂犬病疫苗暴露前或暴露后免疫预防都能有效地快速诱导抗体反应。平均在接种后7 d和30 d分别达到足够的抗体GMT和最高水平。尽管与皮内注射相比,肌肉注射方案的GMT水平较高且下降较慢,但2种方案均可产生足够的GMT。老年人(>50岁)的GMT水平明显低于年轻人(<50岁),达到最大GMT水平的时间也较长。所有暴露后免疫程序均可诱导足够的抗体反应,且持续至少1年。另一项大型系统综述和荟萃分析[4]纳入27项研究共18 630名受试者,比较了不同疫苗(HDCV、PVRV、PCECV)的暴露后预防免疫原性。分析显示,在第7 d的血清抗体阳转率或第14 d的狂犬病病毒中和抗体(rabies virus neutralizing antibody,RVNA)滴度未观察到显著差异。3种狂犬病疫苗的汇总血清抗体阳转率为50.4%(95%CI:29.6%～71.1%),两两之间差异无统计学意义。

我国成功利用微载体技术在生物反应器中大规模培养人二倍体细胞以开发冻干和纯化HDCV。上市前免疫原性研究显示,HDCV较对照组仓鼠肾细胞狂犬病疫苗具有更高的免疫原性。采用Essen免疫程序接种后,两组血清抗体阳转率分别为100%和98.82%。此外,第7 d、第14 d和第42 d的平均抗体滴度分别是对照组的1.71倍、2.72倍和1.29倍[17]。2015年,蔡勇等[18]以1 200名10至60岁高危狂犬病感染的健康人为研究对象,随机分为HDCV组和PVRV组,采用Essen暴露后免疫程序接种。HDCV组和PVRV组首剂免疫后7 d、14 d、42 d的血清抗体阳转率和抗体GMT水平差异均无统计学意义。此外,狂犬病暴露后使用Zagreb免疫程序接种具有良好的免疫持久性,接种疫苗后3年仍具有足够的抗体GMT(0.72 IU/mL),血清抗体阳转率为55.56%。3年内2剂次加强免疫后具有较好的免疫应答,抗体GMT 均显著高于加强免疫前,1年、2年、3年血清抗体阳转率分别为100%、99%和100%[19]。

2020年一项荟萃分析[20]比较了Zagreb和Essen免疫程序的疫苗免疫原性和安全性。共纳入18项研究,其中16项为中国研究,共7 369人和22 631人分别进行免疫原性分析和安全性分析。受试疫苗包括PCECV、PVRV和HDCV。结果显示,2种免疫程序在接种后第7 d和第14 d的RVNA GMT水平差异无统计学意义,但在第7 d的血清抗体阳转率差异具有统计学意义。Zagreb免疫程序可以更快诱导抗体产生,这可能更适合严重暴露的患者尽早产生保护性抗体,从而降低人狂犬病的发病风险。第14 d和第42 d的血清阳转率2组差异无统计学意义。Zagreb组发热发生率较高,但在其他常见不良事件上无统计学差异。

2021年一项随机、双盲、阳性对照、III期临床试验比较了Zagreb和Essen免疫程序接种PVRV在中国健康受试者中的免疫原性[21]。在疫苗接种前抗体呈阴性的受试者中,Zagreb和Essen方案组在第14、35、42 d的抗体阳转率均为100.0%;Zagreb方案组抗体GMT不低于Essen方案组,且均远高于0.5 IU/mL的免疫保护水平。然而,在第7 d,Zagreb方案组的抗体阳转率更高,这表明该方案可更早诱导抗体反应[21]。同年另一项上市后平行对照临床试验结果显示,在所有年龄组的患者中,Zagreb方案并不劣于Essen方案。2种免疫程序的抗体GMT和阳转率差异无统计学意义。第14 d,Zagreb组的所有受试者均获得免疫保护,Essen组有99.16%获得免疫保护。第42 d,2组抗体阳转率均达到100%[22]。

3.3 联合接种研究 多项研究对18～65岁健康成年人联合接种PCECV和乙型脑炎疫苗的免疫原性和安全性进行了评估。结果均显示,2种疫苗联合接种不产生免疫干扰。PCECV联合乙型脑炎疫苗1周内完成免疫接种组与标准免疫程序组(4周内完成免疫接种)的免疫原性相似,具有令人满意的耐受性和安全性[23-25]。

学步期儿童同时接种嵌合乙型脑炎减毒活疫苗和PVRV(暴露前两位点皮内注射或肌肉注射接种)也具有良好的免疫原性和安全性。所有儿童在PVRV接种后均可产生足够的免疫应答(第42 d RVNA滴度均>0.5 IU/mL),2组抗体GMT及血清转化率差异无统计学意义。接种后1年,2组均有92.3%的儿童RVNA滴度持续超过0.5 IU/mL。2种疫苗联合接种后未出现速发反应或疫苗相关的严重不良反应。注射部位不良反应均轻微[26]。

迄今为止,破伤风疫苗对狂犬病疫苗接种的影响尚未得到足够的研究。在一项研究[27]中,研究者使用了PVRV联合吸附白喉破伤风铝佐剂疫苗。结果显示,PVRV组接种疫苗后第21 d的抗体水平为0.68 IU/mL,而联合接种组的抗体水平为0.52 IU/mL(P=0.022)。可见,同时接种白喉破伤风疫苗对狂犬病疫苗的抗体反应有显著的负面影响。上述结果仍需进一步的研究证实。

4 人用狂犬病疫苗研发新进展

开发高效、低毒、安全、廉价的新型狂犬病疫苗佐剂成为目前狂犬病疫苗研究的重要领域[28]。皮卡佐剂是一种TLR3激动剂,能够激活有效的抗原提呈细胞,如树突状细胞,从而产生更强大的适应性免疫。在临床I期研究中已证明其安全性和免疫原性[29]。Kalimuddin等[30]对健康成人进行的II期开放标签随机研究,进一步证实了加速免疫程序(第0 d和第3 d双剂注射,第7 d单剂注射)下皮卡佐剂狂犬病疫苗的安全性和免疫原性。与市售疫苗的标准免疫程序相比,皮卡佐剂狂犬病疫苗的加速免疫程序在健康成人中具有良好的耐受性,并显示出非劣性免疫原性。接种后第7 d,皮卡佐剂狂犬病疫苗接种者的中和抗体阳转率(57.6%)和GMT水平(0.60 IU/mL)均高于对照组(43.8%,0.39 IU/mL)。接种后第14 d的检测结果相似。皮卡佐剂组更快达到RVNA≥0.5 IU/mL。研究未发现新的或临床上重要的安全问题[30]。CV8102是一种TLR 7/8/RIG I激动剂RNA佐剂。首次人体试验研究显示,CV8102单独或与狂犬病疫苗联合接种时,主要引起1级或2级局部或全身反应,无相关严重不良反应发生。25～50 mg CV8102与狂犬病疫苗联合接种可显著增强狂犬病疫苗的免疫原性。50 mg CV8102剂量下,14名受试者中有2人出现严重但自限性的流感样症状[31]。动物模型研究结果显示,鼠伤寒沙门菌外膜蛋白佐剂狂犬病疫苗有利于诱导快速产生中和抗体,并显著升高IFN-γ水平,具有良好的耐受性[32]。

近年来狂犬病新型基因工程疫苗研究获得长足进步,不断涌现出新型疫苗。基于mRNA编码的针对抗原的疫苗在临床前期模型中已被证明是安全的和具有免疫原性的。2017年在医学权威杂志Lancet上发表了一项研究报告了一种基于鱼精蛋白的mRNA疫苗(CV7201)在健康成人中的I期临床试验结果[33]。这项首次在健康人群开展的临床研究结果表明,CV7201在使用无针装置免疫时可以诱导产生针对病毒抗原的功能性抗体,但使用带针注射器免疫时不能产生有效的免疫反应。疫苗总体上是安全的,也具有合理的耐受性[33]。但是鉴于CV7201的安全性问题,研究者进一步研发了采用脂质纳米颗粒包裹的mRNA狂犬病疫苗CV7202。I期临床研究结果显示,1 μg和2 μg剂量的CV7202耐受性良好,无疫苗相关严重不良事件。第43 d 所有受试者的抗体滴度均≥0.5 IU/mL。第57 d,CV7202组抗体GMT与市售疫苗相比差异无统计学意义,在所有受试者中均能引起足够的免疫应答[34]。

猴腺病毒载体狂犬病候选疫苗研究显示出良好的安全性和免疫原性。ChAdO×2 RabG是一种用猴腺病毒作载体的狂犬病候选疫苗,2022年一项首次人体研究[35]旨在评估其在健康成人中的安全性和免疫原性。12名健康成人被分为接受低剂量、中剂量和高剂量ChAdO×2 RabG 3组。受试者未报告严重不良事件。在接种56 d内,中剂量和高剂量组的病毒中和抗体滴度均≥0.5 IU/mL。9名接受中剂量或高剂量ChAdO×2 RabG的受试者在1年后返回进行额外的随访,有7人的病毒中和抗体滴度超过0.5 IU/mL。在这项研究中,ChAdO×2 RabG显示出可接受的安全性和耐受性,并具有令人鼓舞的免疫原性,支持进一步的临床评估。

新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗研究显示出良好的安全性和免疫原性。2021年,印度研究人员研发了一种新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗。随机、对照、多中心、III期临床研究中,800名受试者按2∶1的比例随机接种疫苗(第0 d、3 d、7 d接种3剂)和对照疫苗(第0 d、3 d、7 d、14 d和28 d接种5剂)。结果显示,重组狂犬病病毒糖蛋白疫苗组约9.9%的受试者和对照组约17.2%的受试者报告了不良事件。2组第14 d的血清抗体阳转率差异无统计学意义。可见,新型3剂重组狂犬病病毒糖蛋白疫苗进行模拟暴露后预防接种,在安全性和免疫原性方面不劣于WHO通过资格预审的5剂疫苗。研究者认为,疫苗剂次的减少带来就诊次数和交通费用的减少,并增加了依从性,这对于预防狂犬病非常重要[36]。这些特性对提高接种依从性,加强狂犬病控制计划的成功实施非常重要[37]。

5 人用狂犬病疫苗接种现状及影响因素

随着科学证据的不断更新改进,用于人类暴露后预防的狂犬疫苗剂次已逐渐减少。免疫程序的持续时间最初为3个月共注射6次,减少到1个月注射5次,即Essen免疫程序。然而,完成Essen免疫程序的依从性也只有约60%[38]。在尼日利亚的2项研究中,通过狂犬病实验室登记和儿科医院确定的动物咬伤患者的免疫程序完成率为60.7%。海地动物咬伤患者狂犬病疫苗接种情况分析显示,仅55%的患者接种了所有5剂疫苗。而伊朗仅为16.3%～18.7%,坦桑尼亚为28%,科特迪瓦为47.3%[39]。我国淄博市一项对2 824例狂犬病暴露者的分析显示,疫苗接种依从性为 83.99%[40]。而另一项国内小样本研究中,狂犬病暴露后接种疫苗者仅占10%[41]。疫苗接种率低或不依从的主要原因包括接种时间长、次数多,其他如交通、遗忘等、费用较高、狂犬病认识不足、药物副反应[29],侥幸心理也是重要原因之一[41]。

针对以上原因,建议采取以下对策,首先是推广使用WHO推荐的Zagreb方案,相比Essen方案,Zagreb方案减少了2次去医疗机构及1剂疫苗,且可以达到与 Essen方案相似甚至更好的抗体水平[40]。国内浙江省衢州市一项研究显示,Ⅱ、Ⅲ级犬伤暴露患者对Zagreb方案全程接种依从率分别为92.86%和90.35%,均高于Essen方案的82.83%和79.35%。根据接种成本估算,该市采用Zagreb方案的总成本将节约369.8万元,经济负担明显减轻[42]。其次,充分利用各种媒介(社区发放、张贴宣传资料、网络论坛、电子信息等)宣传狂犬病相关知识,特别是加强对农村居民狂犬病防治知识的宣传教育。已有研究表明,人们对于收到有关狂犬病疫苗接种的短信提醒的态度是积极的[43]。海地之前的大规模狂犬病疫苗接种活动表明,使用短信进行疫苗接种提醒是提高社区意识和参与度的有效策略[44]。国内有研究显示,微信平台的延续护理干预可显著提高狂犬病疫苗的全程接种依从性[45]。再者,提高农村居民的经济收入,并加大和提高新农合的参保率,增加狂犬病暴露后处置费用的补助额度。

6 结 语

我国是狂犬病流行国家,消除狂犬病是全社会的责任。狂犬病疫苗是人类战胜狂犬病最主要的武器。近年来,国内外人用狂犬病疫苗领域研究不断推进,后续有关疫苗的暴露前和暴露后免疫,无论是安全性评价还是免疫原性评价及接种程序的临床应用研究都值得进一步深入探索。此外,任何新型狂犬病疫苗的探索性努力也都将为实现“2030年人类狂犬病零死亡”提供更大的可能。然而,狂犬病免疫预防目前亟待解决疫苗接种依从性差的难题,在加大狂犬病及其疫苗知识宣教力度基础上,探索更加简易且免疫原性和安全性俱佳的免疫程序,以及具有潜力的新型疫苗的研发均将为之带来新的解决途径。

利益冲突：无