黏菌素耐药基因mcr-1的研究进展

朱琪琪,路宁宁,王承业,吴灵玉,张继瑜,朱 阵,王玮玮

抗菌药物以预防疾病和促生长作用广泛应用于畜禽养殖业。我国作为畜禽养殖大国,抗生素市场的需求量巨大。据统计,我国2017年抗菌药物的使用量为41 967吨,占全球使用量的45%,是最大的兽用抗菌药物消费国[1]。但由于抗生素的不合理使用,导致耐药菌株的大量产生和耐药基因的快速传播,给公共卫生安全和畜禽养殖业健康发展带来了极大的挑战。同时耐药菌株也被认为是一种新型的环境污染物,影响着整个生态系统。有研究表明,畜禽是人类耐药性致病菌的储库,人类约有60%的细菌性疾病源自动物病原菌感染,食源性耐药致病菌会沿着“养殖动物-环境-食品-人群”链条传播[2]。黏菌素曾经广泛应用于临床,但由于药物严重的肾毒性等副作用,黏菌素已不再作为一线治疗药物,只作为多重耐药感染(如产生碳青霉烯酶的肠杆菌科)的最后防线药物使用。以往的研究发现黏菌素的耐药机制由染色体介导,并不会在细菌间广泛传播,而2015年我国研究人员发现了位于质粒上的黏菌素抗性基因mcr-1(mediated colistin resistance,mcr),这种抗性基因能够在菌种间水平传播,引起了各国学者的广泛关注[3]。该类耐药细菌和其他耐药基因尤其是碳青霉烯类耐药基因(blaNDM、blaKPC等)共存形成名副其实的“超级细菌”[4],极大地威胁了人类的生命健康。随后,农业部开始限制黏菌素在养殖业的使用,并于2017年禁止将其作为饲料添加剂。mcr-1的发现与流行,使人们重新审视黏菌素的耐药机制,也对抗生素的使用更加谨慎。本文阐述了mcr-1的流行情况及mcr基因产生耐药性生化机制,为mcr-1耐药性研究提供前期基础材料。

1 mcr-1基因的发现

2015年之前的研究认为,黏菌素的耐药机制主要由染色体上的phoPQ和pmrAB双组分调控系统介导。双组分调控系统主要通过4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)和/或磷酸乙醇胺(pEtN)对脂多糖(LPS)进行修饰,使细胞外膜电位上升以减少阳离子多肽与抗生素的结合位点,从而降低黏菌素对细菌的亲和力,使细菌在抗生素压力下更好的定植和生长[5]。随着2009年超级耐药基因NDM(New Delhi Metallo-beta-lactamase,NDM)的发现,导致CRE几乎无药可用,人们不得不重新使用(如产生碳青霉烯酶的肠杆菌科)“最后一道药物防线”之一的黏菌素进行多重耐药感染的治疗,因此黏菌素备受关注。然而,2015年底出现的质粒介导的黏菌素抗性基因(mcr)已经严重威胁到了黏菌素的临床有效性,该基因的发现打破了黏菌素的耐药机制只有染色体携带的观点,引起了全世界的广泛关注,细菌对黏菌素耐药的现状也亟需被重新评估。刘健华和沈建忠团队首次从猪源大肠杆菌中分离到由质粒介导的可移动黏菌素耐药基因mcr-1,该基因全长1 626 bp,位于IncI2型质粒上,其上游含有插入序列ISApl1[3](Insertion Sequence,IS)。该研究表明mcr-1耐药基因不仅能通过水平转移方式传递到受体大肠杆菌C600(EC600)中,还能在传代14 d后稳定存在[3]。随后,世界各地相继在动物、人、食品以及环境中均检测到了mcr-1基因,之后又相继报道了9种mcr基因的亚型。为了遏制mcr耐药基因的快速蔓延,我国已于2017年5月1号禁止将黏菌素用于养殖业的促生长饲料添加剂。

2 mcr-1基因介导的耐药机制

刘健华团队对畜禽源大肠杆菌耐药性进行检测时发现黏菌素耐药性持续上升,并发现质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的存在。该基因所编码的磷酸乙醇胺转移酶(phosphoethanolamine transferase,PEA)通过修饰脂质A使细胞外膜负电荷减少,降低了细菌对黏菌素的敏感性[3]。mcr-1基因全长1 626 bp,编码541个氨基酸即为MCR-1蛋白,经过序列比对分析发现与PEA具有较高的同源性,并具有PEA活性,属于YhjW/YjdB/YijP超家族[3,6]。实验研究表明,MCR-1蛋白N-端含有5个跨膜的α螺旋结构和C-端的催化区结构,在天然条件下,MCR-1蛋白C-端存在一个活性口袋,包含两个锌离子和水分子配位的未磷酸化的亲核残基Thr285,且催化区的5个残基E26、T285、H395、D465和H466可能与底物结合活性有关。跨膜结构能够将MCR-1锚定在细胞膜的周质面,在周质中将磷酸乙醇胺添加至脂质A,使细胞外膜的负电荷减少,引起细菌对黏菌素产生抗性[6-8]。mcr-1基因位于质粒上,可在细菌之间进行水平基因转移,使细菌能够快速捕获外源性耐药基因,进而对黏菌素产生耐药性。迄今为止,mcr基因家族成员已扩充到10个,其中mcr-1的传播最广,且突变率极高。在抗生素选择性压力下,mcr基因也在不断进化,使其具有丰富的遗传多样性,且对多种菌株具有良好的适应性,造成其广泛的传播和流行。

3 mcr-1基因的流行

中国曾是黏菌素生产和使用最多的国家之一,而黏菌素的大量使用使细菌在高强度选择性压力下不断进化,最终获得具有黏菌素抗性的mcr-1基因,并在此基础上产生多种变体,加速了mcr-1基因在细菌间水平传播。

3.1mcr-1基因在动物-环境-人群中的流行 自mcr-1基因在我国被首次报道后,多个国家相继在人群和动物以及环境中检测出mcr-1基因。在使用黏菌素的国家中,食品动物的mcr检出率往往呈现一种广泛的流行,mcr-1阳性分离株最早可追溯到上世纪80年代[9],并在2009年大规模增长[10]。随着黏菌素在畜禽中的大量使用,mcr-1基因或许早已出现,并于十几年前小规模爆发,较高的检出率表明食品动物可作为耐药基因储存库,同时在抗生素的选择性压力下耐药菌株不断增强自身的适应性与抗性基因的水平转移。尤其是mcr-1基因插入到其他耐药基因的质粒上,不仅加剧了细菌的耐药现象,也导致了抗生素治疗的选择压力。

环境由于其不可控等因素为耐药基因的转移传播提供了良好的条件,随着研究人员对mcr-1基因研究的深入,该基因不断在各种环境样品中检出[11-12],尤其是在人类赖以生存的水资源中。研究人员从医院污水、处理后的污水、河流和湖泊、甚至在人类饮用水中均分离出mcr-1阳性大肠杆菌[13-16],部分菌株甚至同时携带多种耐碳青霉烯类基因,这无疑会进一步加重耐药基因的传播。抗性基因随着水介质的流动性进行远距离传播,最终可能成为人类的饮用水,而一般的处理技术并不能消除饮用水中的耐药基因。环境是耐药细菌和耐药基因的一个重要传播途径,给人类和各种动物体内耐药基因的流行和传播造成一定的风险,因此控制环境中耐药基因的传播是减少耐药菌株阳性率的重要一环。

在人群mcr-1的流行病学调查中,多项研究发现大肠杆菌的mcr-1阳性携带率均远远高于其他肠杆菌科细菌,表明大肠杆菌可能是mcr-1阳性菌株的主要宿主[17-18]。大肠杆菌的阳性率较高可能是其作为一种常见细菌,广泛分布于各种环境中,而黏菌素的大量使用导致养殖动物不断对黏菌素耐药基因进行选择,使耐药菌株和抗性基因在不同环境中交叉传播,与其他健康人群相比,暴露于mcr-1阳性动物的人群表现出较大的mcr-1基因的定植风险[19]。mcr-1阳性菌株在健康人群中的流行与畜禽和水产养殖、肉类年总消费量以及水产品的日摄入量有关[20],而在院内的流行则与男性、免疫抑制或在过去3个月内接受过抗生素(尤其是碳青霉烯类和氟喹诺酮类药物)治疗等因素有关[17]。曾报道宠物主与宠物狗体内携带相同ST型的mcr-1阳性大肠杆菌,且携带相同的其他耐药基因,表明产生mcr-1的菌株极有可能在人类和宠物之间传播[21]。总体来说,人群中mcr-1基因的流行率低于动物源性,但随着mcr-1基因不断在人群中检出,mcr-1基因可能在未知的环境压力下不断进化,仍需要加强该基因的流行病学调查和监控。

mcr-1基因呈现多样的复杂性,其分布范围不仅涉及到人源(健康人群和感染患者)、动物源(食用动物、伴侣动物和野生动物),还涉及到食品源(蔬菜类、海产品和肉类)和环境(废水、井水、河流湖泊、饮用水和海水)中,可能会形成广泛的传播和流行。

3.2mcr-1基因在国际中的流行传播 抗生素抗性基因不受生态、地理位置和政治边界的限制,可以通过各种媒介如动物、食品、水源甚至人类等,在短时间内进行远距离传播,甚至洲际传播。研究人员在迁徙性鸟类分离出mcr-1阳性大肠杆菌,部分序列型分离物先前已在人类血流感染中发现[22-23],可见野生迁徙鸟类在一定程度上介导了耐药基因的环境迁移。mcr-1基因不断在无抗生素压力的野生动物身上检出,可能是这些野生动物在迁徙过程中接触到mcr-1基因污染的环境或食用携带该基因的食物,导致mcr-1基因通过环境-候鸟-环境这一循环途径呈现全球性传播。部分野生鸟类可能会以淡水鱼或海水鱼为食,而畜禽养殖业和淡水养殖业对水环境中黏菌素耐药性的产生和传播起到了至关重要的作用,尤其是水禽和淡水鱼虾混养模式,当水禽通过将含有mcr-1基因的粪便排进水体时,可能会导致水体污染以及水生生物感染耐药基因,长期存在时则极有可能加快了耐药细菌进化和抗性基因传播的速度[24]。

在科技高度发展的今天,世界日益成为一个联系紧密的整体,食品贸易越来越便利,人类跨国出行也越来越普遍,mcr-1基因可能通过这一途径进行远距离水平传播。从进口的鸡肉样品中检测到高流行性ST131型mcr-1阳性大肠杆菌,此序列类型曾在患病者体内被报道,可能是mcr-1基因传播及扩散的重要ST型[25]。除了食品贸易使mcr-1基因快速传播,人口流动亦是一种跨国传播途径。有研究者对1 847名荷兰旅行者进行了一项回溯性研究,在这些旅行者返回荷兰后1～2周内采集的样本中分离出mcr-1阳性大肠杆菌,而旅行之前的样本中并未检出,在旅行期间也并未接受过医疗服务或使用抗菌药物[26]。

海水是海洋生物生活的媒介,也是各种水系的最终受体,当海水受到抗性基因的污染时,便可作为传播抗生素抗性基因的储存库。Jorgensen等[27]从挪威的一个公共海滩的海水中分离出携带mcr-1的ST10型大肠杆菌,同样也有学者从巴西的公共海滩分离出ST10型的mcr-1阳性大肠杆菌[28]。除了在海水中发现mcr-1基因,研究人员也在海产品中发现mcr-1基因,从而能够使该基因在较短时间内通过食品贸易全球性传播[29]。此外,鱼类作为一种重要的海洋生物,可以从海水中摄取携带抗性基因的细菌,以海水鱼为食的野生鸟类可能因食用携带该耐药基因的鱼类从而被感染,尤其是野生迁徙性鸟类在增大mcr-1耐药基因分布范围的同时,也使mcr-1耐药基因的环境更加复杂。

以质粒介导的耐药基因具有强大的水平传播能力,可以在人、动物、环境中进行二次或多次传播,即从动物向环境的传播—包括土壤、水源等的传播,动物向人的传播-养殖人员、非养殖人员,动物产品(肉、奶)向人的传播,形成“体内-体外-体内”循环污染路径,最终造成耐药污染的潜在巨大风险。在我国畜禽养殖规模和从业人员规模迅速扩大、产品消费流通加速的大背景下,在黏菌素普遍产生耐药性和新型抗菌药物开发缓慢的大环境下,如何有效应对细菌耐药性仍是一个巨大挑战。

4 mcr-1基因的传播机制

4.1 质粒介导的传播 质粒是一种独立于染色体之外能够自我复制的DNA遗传元件,编码细菌生长的非必须基因,可分为骨架区和外源插入区,后者可携带利于细菌生长的转座子、整合子等移动元件[30]。同样位于外源插入区的mcr-1基因在具有黏菌素抗性的肠杆菌科的水平传播中起着重要作用,而携带mcr-1基因的相关质粒是快速传播的关键。质粒主要以接合的方式在细菌间转移,其水平传播的能力取决于多种因素,包括质粒自身的宿主范围、接合频率、与转移相关的tra操纵子及其他相关基因。

目前为止,已发现10余种携带mcr-1基因的质粒,包括IncI2、IncHI2、IncP、IncX4、IncY、IncF、IncFI、IncFII、IncFIB、IncI1、IncHI1、IncN和IncK等,其中IncI2、IncX4和IncHI2为主要流行的质粒型[31]。除此之外,也有研究报道mcr-1基因定位于IncX3-IncX4和IncI2-IncFIB等杂合质粒[32-33]。IncI2和IncX4为窄宿主质粒,通常只见于大肠杆菌,IncX4质粒能够以较高频率(10-1～10-4)在细菌间发生接合转移[34-35];IncHI2拥有多个复制子结构,极有可能会增加宿主范围,此外,其接合转移最佳温度为22 ℃～30 ℃,并拥有两套接合转移系统,这种独特的温敏型转移机制使其有利于在环境中传播[36]。IncI2和IncX4质粒(<100 kp)基因环境较为保守,通常仅编码mcr-1,且多数分离株mcr-1上下游失去插入序列ISApl1;IncHI2质粒(177～340 kb)基因环境呈现多样性,通常含有可变区且携带其他抗性基因,多数分离株mcr-1上下游含有插入序列[37-39]。

4.2 移动元件介导的传播 转座子是一段能够独立移动的DNA序列,由编码抗生素耐药基因或其他功能的中心区域和上下游的插入序列组成,造成细菌耐药性的多样化[40],如与黏菌素耐药相关的插入序列ISApl1和转座子Tn6330等。插入序列是最简单的转座子,自身不携带耐药基因,一般仅携带一个编码转座酶的tnp基因,其上下游含有反向重复序列IRL(Inverted Repeats of Left)和IRR(Inverted Repeats of Right),IRL和IRR是插入序列进行转座时转座酶特异性识别的位点[41]。mcr-1的上游常常出现插入序列ISApl1,被认为与mcr-1的水平传播有着密切的联系,该基因下游通常存在一个假设蛋白(hypothetical protein,hp),该假设蛋白与编码磷酸酯酶的PAP2超家族有较高的同源性,研究表明该蛋白对黏菌素的耐药性无影响,可能与mcr-1基因从原始遗传背景共同移动[42-43]。

ISApl1属于IS30家族,其上游的IRL可以识别IRR并与mcr-1共同形成环状中间体插入到质粒或者染色体上,同时在插入位点产生2～3 bp的重复序列[44]。Li等[38]通过反向PCR证实结构单元ISApl1-mcr-1-pap2-ISApl1能够形成环状中间体,并将此复合转座子命名为Tn6330。mcr-1基因的水平转移可由其携带ISApl1元件的转座子表达,转座子在失去上下游两个ISApl1元件后无转移能力,从而稳定存在于质粒或者染色体中,虽一个拷贝也能保持一定的转移能力,但上游的拷贝在功能上更重要[45]。Wang RB等[45]比较人类(n=108)和动物源(n=252)耐黏菌素的分离株,发现在动物源分离株的上游和下游都有明显更多的ISApl1插入序列,说明动物源分离株中的mcr-1基因更容易水平传播。除了ISApl1外,mcr-1的上下游也出现了其他插入序列,比如IS26、IS2和IS1294等。ISApl1元件与IncHI2型质粒的转移密切相关,而IS26元件与IncX4型质粒密切相关[39]。插入序列IS26能够通过启动子的-35区域偶联-10区域形成强启动子,从而促进耐药基因的高效表达[46]。研究表明IncX3和IncX4型杂合质粒形成共整合体之前均含有IS26插入序列,而两种质粒重组连接点为转座酶介导的IS26和oriT的nic位点[32]。转座酶Tnp26通过两个已经存在的IS26之间的保守反应催化共整体的形成,当目标质粒含有IS26时,共整体形成的频率比不携带IS26高出60倍[46-47]。mcr-1仍然可以与其他含有相同插入序列的质粒重组,形成更复杂的杂合质粒并产生黏菌素抗性。

5 mcr-1基因的适应性

细菌的适应性一般是指细菌在不利环境中通过调节自身代谢来维持生存与繁殖所产生的代价,即在无抗生素压力时,耐药菌株相比较敏感菌株通常会出现生长速率、竞争能力或毒力降低[48]。目前,研究人员已经从宿主类型、质粒类型、体内与体外、染色体与质粒、耐药水平等多个维度进行mcr-1阳性菌株的适应性研究[49-54],虽然研究的结果不尽相同,但普遍认为mcr-1所产生的适应性成本可能与宿主和质粒类型有较大关联,而质粒中的某些基因可以补偿这种适应性成本。

由于染色体介导的耐药性不易在菌株间水平传播,还会带来较高的适应性成本[49],故而mcr-1基因通常由质粒进行传播。在携带mcr-1基因的主要质粒中,IncI2质粒对宿主的适应性能力强于IncX4质粒,IncX4质粒强于IncHI2质粒,进一步解释了mcr-1位于IncI2和IncX4质粒多于IncHI2质粒[52]。IncI2可编码的ProQ/FinO家族蛋白,通过抑制质粒拷贝数来平衡mcr-1基因在宿主内的表达和适应性[55]。IncX4属于自转移质粒,其转录调节基因pixR通过与转移操纵子的启动子结合并激活核心转移基因,不仅增加了IncX4质粒的转移能力,同时降低了携带mcr-1基因所产生的适应性成本[56]。此外,IncX4质粒的组蛋白样核结构蛋白H-NS,通过控制接合过程中的能量来提高质粒的适应性[57]。而携带mcr-1的IncHI2质粒最初产生了适应性成本,但在长期培养后,适应性成本在很大程度上得到了补偿[58]。

临床上mcr-1阳性分离株以低水平表达为主,高水平表达菌株往往会出现细胞膜结构损坏使细菌代谢失衡,从而在生长速度、竞争能力和细胞结构等方面表现出适应性代价,可见细菌能够巧妙地平衡mcr-1介导的耐药性与适应性成本之间的关系[51,53-54]。mcr-1在宿主中的表达受到了精确的调控,可能与菌株的基因组背景有关。

6 结 语

mcr-1基因是世界上首个发现由质粒介导的黏菌素耐药基因,禁止黏菌素用于畜禽养殖业只是防控细菌耐药的必然一步,现有的研究对mcr-1的结构及其变异体、流行现状、耐药机制等多个方面进行了探索,仍然还有很多问题需要人们去解决。为了控制黏菌素耐药基因的蔓延,关于mcr耐药基因的研究已广泛展开,通过逆转黏菌素耐药性[59]、CRISPR/Cas9基因敲除[60]、消除耐药质粒[61]等研究希望恢复细菌对抗生素的敏感性。针对临床感染患者病例可采用联合用药并通过PK-PD(药动/药效学)模型,优化临床给药方案以减少黏菌素的使用。我国动物源耐药性十分严重,黏菌素耐药基因的出现只是冰山一角,因此,已于2017年建立动物源细菌耐药性检测网络,以评估耐药性风险及防控策略。为了应对细菌耐药性的产生,因此急需研发新药及升级耐药性防控技术,包括开发新型抗菌药物(发现新的抗菌机制和靶点等)、升级现有抗菌药物(联合用药及改造抗菌药物结构等)和寻找抗菌药替代物(中草药、噬菌体等)等。耐药菌和耐药基因可通过食物链传递至人类,如何减少抗菌药物的使用,从源头切断耐药菌和耐药基因的传递链,也是遏制细菌耐药基因传播的重要策略。

利益冲突：无