BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)在食蟹猴体内的免疫原性

黄 帅,王 汀

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病,人病死率约100%[1]。暴露后最有效的防治手段是及时清洗伤口、接种免疫球蛋白及全程接种人用狂犬病疫苗[2-3]。狂犬病疫苗主要通过培养动物性细胞获得,如Vero细胞疫苗、原代地鼠肾细胞疫苗及人二倍体细胞疫苗[4]。人二倍体细胞疫苗,系采用健康人胚肺成纤维细胞(MRC-5)培养狂犬病病毒,经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后制备而成,有着无潜在致瘤DNA残留和无外源蛋白过敏风险的优势,且具有更好的免疫原性[5]。

佐剂为一种非特异性免疫增强剂,能增强机体对抗原的免疫应答,增强免疫反应。BCG-CpG-DNA佐剂为一种新型生物佐剂,是从卡介菌(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)中提取的富含未甲基化CpG基序,该核酸片段具有强烈的免疫激活功能。其主要功能为刺激巨噬细胞、DC、B细胞等细胞成熟活化,激活TLR9受体,从而介导激活固有免疫并诱导机体建立强烈的Th1型免疫反应;并诱导IFN-α/β和IFN-γ等多种细胞因子的分泌,促进抗病毒反应,调节免疫应答,提高抗体水平[6-7]。

Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,可通过检测IL-2、IFN-γ细胞因子表达水平来体现机体Th1型免疫反应的强弱。

本研究评价了BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)在食蟹猴体内的免疫原性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 疫苗 BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)由安徽智飞龙科马生物制药有限公司制备,1.0 mL/剂;冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)由成都康华生物制品有限公司生产,1.0 mL/剂。

1.2 实验动物 普通级食蟹猴12只,雌雄各半,3～5岁,雄性体重 3.33～4.98 kg,雌性体重 2.56～3.29 kg,由广西防城港常春生物技术开发有限公司提供,生产许可证号:SCXK桂2018-0005。

1.3 主要试剂及仪器 RFFIT实验用狂犬病人免疫球蛋白国家标准品购自中国食品药品检定研究院;RFFIT实验用FITC标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体,购自德国默克密理博公司;倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司;荧光化学发光分析仪购自美国CTL公司;Monkey IL-2ELISpotPLUS(ALP)及Monkey IFN-γELISpotPRO(ALP)细胞因子检测试剂盒购自MABTECH公司。

1.4 动物分组及免疫 将12只食蟹猴随机分为对照组、3针组及4针组,每组4只,雌雄各半,经后肢肌肉免疫,1.0 mL/剂。对照组接种市售冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞),按萨格勒布(Zagreb)方案[8],于0 d(2剂)、7 d及21 d各1剂,共4剂;4针组及3针组均接种BCG-CpG-DNA佐剂疫苗(MRC-5细胞);4针组按美国ACIP方案[9],于0 d、3 d、7 d及14 d各注射1剂,共4剂;3针组在Zagreb方案基础上,将0 d的免疫降为1剂,其他免疫程序不变,共3剂。于初免当天(0 d)及初免后7 d、14 d、28 d、35 d、49 d、63 d后肢隐静脉采血,分离血清及外周血淋巴细胞,分别进行体液免疫中和抗体检测和细胞免疫细胞因子检测。

1.5 免疫原性分析 采用《中国药典》(四部)(现行版)中的快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗体,以血清中和抗体效价<0.5 IU/mL判为阴性,≥0.5 IU/mL判为阳性[10]。采用酶联免疫斑点检测技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测食蟹猴免疫前后外周血淋巴细胞中细胞因子IL-2及IFN-γ的表达水平。

2 结 果

2.1 抗狂犬病病毒中和抗体水平 免疫前,各组食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗体水平均呈阴性,抗体转阳率均为0%;首剂免疫后7 d,各组血清中抗体均>0.5 IU/mL,抗体阳转率均为100%。初次免疫后7～28 d,对照组及3针组血清中抗体水平呈上升趋势,至28 d达最高,之后均呈下降趋势;4针组在14 d达最高,之后呈下降趋势。初次免疫后28 d,对照组、3针组中和抗体水平显著高于4针组(t=2.529、4.068;P<0.05、P<0.001);初免后35 d,3针组中和抗体水平显著高于4针组(t=3.277,P<0.01),其他同时间点各组血清中和抗体水平未发现差异无统计学差异;免疫后血清中抗体总水平为3针组>对照组>4针组,见表1,免疫后各组血清中和抗体变化趋势见图1。

图1 各组食蟹猴血清中不同免疫时间抗狂犬病病毒中和抗体水平趋势图

表1 各组食蟹猴血清中不同免疫时间抗狂犬病病毒中和抗体水平

2.2 细胞免疫水平分析 初次免疫后,各组食蟹猴外周血淋巴细胞中IL-2水平在7～14 d呈上升趋势,至14 d达最高,之后呈下降趋势,同时间各组外周血淋巴细胞中IL-2水平均未发现差异有统计学意义,免疫后IL-2总水平为3针组>4针组>对照组。初次免疫后,对照组外周血淋巴细胞中IFN-γ水平在7～28 d呈上升趋势,至28 d达最高,之后呈下降趋势;3针组及4针组IFN-γ水平在7～14 d呈上升趋势,至14 d达最高,之后呈下降趋势;初免后14 d,3针组IFN-γ水平显著高于对照组,其他同时间点各组间IFN-γ水平差异无统计学意义;免疫后IFN-γ总水平为3针组>4针组>对照组,佐剂疫苗组IFN-γ较对照组的提前至14 d达高表达水平,见表2,免疫后外周血淋巴细胞中IL-2、IFN-γ水平变化趋势见图2。

图2 各组食蟹猴外周血淋巴细胞中不同免疫时间细胞因子水平

表2 各组食蟹猴外周血淋巴细胞中不同免疫时间细胞因子水平(斑点数/孔,

3 讨 论

狂犬病作为死亡率最高的传染病之一,一旦发病,目前没有有效的药物可以治疗[11]。接种狂犬病疫苗是预防狂犬病感染的必要途径,但在一些发展中国家的使用仍然不足,致命的感染数量很高[12]。其中,人二倍体细胞疫苗作为国际公认的金标准疫苗,生产工艺复杂、价格昂贵、限制其广泛应用[13]。因此新一代狂犬病疫苗研发需要降低成本和减少接种程序[14],而添加佐剂成为热门研究方向,历史上曾经使用过铝佐剂的狂犬病疫苗,但由于其延缓中和抗体产生的时间,并且只诱导体液免疫,反而不利于狂犬病的预防[15],基于此,目前上市的灭活狂犬病疫苗都未添加佐剂,这也导致需要使用高浓度的抗原来确保免疫效果,从而导致高昂的成本。因此需要开发新型的佐剂狂犬病疫苗,通过提高免疫效果、降低成本,以助力WHO提出的2030年消灭人间狂犬病的目标[16]。

目前人们一直致力于狂犬病疫苗新型佐剂的研究,如鞭毛蛋白佐剂、植物型多糖佐剂、CpG佐剂[17-18]等,其中BCG-CpG-DNA 作为天然的富含未甲基化CpG基序,与TLR9特异性结合,具有明显的免疫激活作用,被认为是一种有效的新型疫苗佐剂[19],已有研究证实在小鼠等模型中CpG可以减少狂犬病毒抗原使用量和免疫球蛋白使用量[20],但对免疫程序的研究尚有不足,尤其在非人灵长类模型中。目前,我国狂犬病暴露后推荐的免疫程序为5针法和2-1-1法,在2018年《狂犬病疫苗:WHO立场文件》中推荐暴露后免疫程序为简易4针法和2-1-1法。在保证效果的同时节约费用和就医程序,可以显著提高患者依从性、减轻负担[21]。因此,在本实验中使用4针法及简易3针法来探讨BCG-CpG-DNA佐剂狂犬病疫苗的免疫效果。在本实验中将食蟹猴随机分为3针组、4针组及对照组,各组食蟹猴血清检测结果显示,3针组、4针组及对照组免疫前血清样本中抗狂犬病病毒中和抗体水平均<0.5 IU/mL,呈阴性;在初次免疫7 d的抗体阳转率均达100%,该阳性状态可维持至少63 d;对照组和3针组在28 d抗体滴度均达最高,分别为215.95 IU/mL、293.20 IU/mL;4针组在14 d抗体滴度达最高,为100.95 IU/mL,远超过《狂犬病预防控制指南(2016版)》规定的0.5 IU/mL阳转值标准。初免后28 d,对照组、3针组中和抗体水平显著高于4针组。免疫后14 d开始,3针组中和抗体均值均大于4针组,免疫后28 d开始,3针组中和抗体平均值均大于对照组,整体血清抗体水平表现为3针组>对照组>4针组。显示该佐剂疫苗在减少免疫剂量的情况下体液免疫反应未降低。

3针组和4针组食蟹猴初次免疫后,外周血淋巴细胞表达的IL-2及IFN-γ水平均在14 d达最高,其中3针组IFN-γ的水平显著高于对照组,4针组IFN-γ平均值约为对照组2倍;对照组IL-2细胞因子表达水平趋势与3针组及4针组一致,但IFN-γ水平在首免后28 d才达最高,但平均值与3针组、4针组的14 d表达水平相当。整体细胞因子水平表现为3针组>4针组>对照组,显示该佐剂疫苗可能更早的引起机体产生细胞免疫应答,且在减少剂量的情况下细胞免疫反应未降低。

综上所述,接种BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)和接种市售冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)后均能引起食蟹猴较高水平的特异性免疫应答,且该佐剂狂犬病疫苗在简易3针免疫程序下,产生的细胞免疫和体液免疫不弱于对照组的2-1-1程序,表明该佐剂疫苗具有较高的保护水平,较全面协同的体液免疫和细胞免疫保护机制,并可能减少免疫接种针次,在优化狂犬病疫苗免疫接种程序中具有潜在价值。

利益冲突：无