人造血液的研究进展

任 烽，金怡杉，陈 露，荣 龙，余春红

北京航空航天大学 1.生物与医学工程学院；2.医学科学与工程学院，北京 100191

血液是一种非常重要的医疗资源,具有运输、防御以及缓冲作用。虽然中国无偿献血人次与献血率在逐年增加,但采供血机构供血不足与临床需血量逐年增长之间的矛盾时有发生,血液仍然是严重稀缺资源。同时,天然血液易变质,储存要求严格,调剂使用的成本高,还有潜在的交叉感染隐患,需要通过病历质量控制系统监控输血病例[1]。因此,寻找一种安全有效的人造血液迫在眉睫。

1 人造血液的概述

人类全血是非常复杂的,人造全血几乎是不可能的。目前所说的人造血液,一般指的是可以承担正常血液携氧和运输等功能的血液代用品,主要可分为生物合成的具有完全生物学功能的红细胞和人工合成具有红细胞主要功能的替代物两种。人造血液可以用于外伤、手术等可能导致的大出血,而近年来,研究者也尝试开展将其用于缓解肿瘤缺氧、遗体器官的保存、一氧化碳中毒的治疗,以及体外灌注和心肌保护的研究。相比天然血液,人造血液储存条件更宽松,保存时间更长,且在使用时不需要考虑血型是否适配,还可以有效避免输血时感染艾滋病、肝炎等传染病的风险。但目前很多针对人造血液的研究还只停留在动物实验阶段,只有少数进入到临床试验,其中部分因引起心血管并发症以及肾损害等副作用,研究一度终止。本文主要总结人造血液的研究现状以及应用,并展望人造血液的未来前景。

2 人造血液的研究现状

人造血液根据其性质可分为人工合成的血红蛋白、天然血红蛋白制成的人工红细胞、全氟碳化合物和干细胞4大类。其中,天然血红蛋白制成的人工红细胞是当前主要研究方向。

2.1 人工合成的血红蛋白

2.1.1 重组血红蛋白(hemoglobin,Hb):目前除大肠杆菌表达系统、转基因小鼠和猪外,关于人类Hb的表达有了新的构想和突破。使用病毒载体,通过小肽连接子连接已构建了以植物为基础的无内毒素的功能性重组融合人胎儿血红蛋白(human fetal hemoglobin,HbF)表达系统,成功生产了大量纯度高且与天然HbF结构和功能相似的rfHbF,解决了大肠杆菌表达系统产物易变性等问题,开拓了重组Hb生产的思路[2]。

2.1.2 基于血红素的氧载体:血红素是天然血红蛋白的运氧活性位点。因此,研究者尝试开发含Fe2+的卟啉氧转运体系以实现类似天然血红蛋白的氧结合能力。针对该体系位于水介质中易发生不可逆氧化的问题,有研究者通过使用人血清白蛋白颗粒等构建疏水环境,提高了其稳定性[3]。然而近年针对基于血红素的氧载体研究相对较少,缺少进一步开发和验证。

2.1.3 树状大分子:树状大分子是一种具有重复分支结构的高分子物质,因其大小及其他仿生特性被称为“人造蛋白质”,可开发为基于细胞的具有生物相容性的血红蛋白产品。现已开发出一种名为超支化聚合物的树枝状大分子,通过将Fe2+嵌入中央卟啉,模拟血红蛋白与氧气的结合[4]。

2.2 天然血红蛋白制成的人工红细胞

Hb在红细胞内存在时活性最高。当Hb以无细胞形式存在时,血红蛋白四聚体会迅速解离为二聚体和单体,与2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)分离并通过其血红素基团清除一氧化氮(NO)分子,导致肾损害和心血管并发症等[5]。为解决这些问题,将天然Hb置于化学修饰的无细胞悬液中,或者与保护酶一起同聚合物结合和交联,封装在基于生物材料的纳米载体和微载体中,制成血红蛋白氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs)。根据修饰方法,HBOCs主要分为脱细胞HBOCs和细胞HBOCs两类。

2.2.1 脱细胞HBOCs:如图1所示,根据阻止Hb在无细胞环境中自发分离的修饰种类可以将其分为3大类:共轭修饰型血红蛋白(conjugated Hb)、交联型血红蛋白 (crosslinked Hb)和聚合型血红蛋白(polymerized Hb)。

图1 脱细胞HBOCs的分类Fig 1 Classification of acellular HBOCs

2.2.1.1 共轭修饰型血红蛋白:以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)为代表的可溶性大分子可以和血红蛋白表面赖氨酸等活性基团反应,附着于表面增加血红蛋白的稳定性和流体力学半径,防止四聚体解离和外渗,提高在血液中的循环半衰期,同时,覆盖抗原位点,降低免疫原性。Hemospan(即MP4)是一种利用亚硝基硫醇烷对Hb表面位点进行硫醇化修饰,再偶联马来酰亚胺激活的PEG(分子质量为5 ku)而得到的PEG化人血红蛋白。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明Hemospan在人体内对高效氧气输送的耐受性良好,然而进一步试验显示,MP4OX(含氧MP4)与天冬氨酸转氨酶等浓度的短暂升高、心动过缓、恶心和高血压等不良事件有关,存在心血管和肾功能障碍风险。动物实验显示,用一氧化碳饱和MP4制备的MP4CO具备预防和逆转红细胞镰状化的潜力,然而1b期临床试验表明,相比对照组,MP4CO实验组患者出现头痛、疲劳和皮疹等不良反应概率更高[6],近年未见更进一步的临床试验报道。除PEG外,使用聚多巴胺(polydopamine,PDA)修饰蚯蚓血红蛋白和牛血红蛋白后产品具有良好的体外携氧性能,且PDA修饰的蚯蚓血红蛋白在体外具有良好的携氧活性与安全性,抗吞噬性更优,有望获得更长的循环内滞留时间,是一种颇具希望的崭新血红蛋白氧载体设计,值得进一步研究[7]。

2.2.1.2 交联型血红蛋白:血红蛋白由两个α-亚基和两个β-亚基组成,使用位点特异性交联剂可以使亚基之间产生分子间共价键稳定结构,防止四聚体被解聚产生肾毒性或被肾滤过,延长其在血管内的存留时间。HemAssist是通过富马酸酯交联人血红蛋白两个α亚基的产品,在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中患者对其总体耐受良好,但后期临床试验显示,输注HemAssist可能会增加患者患胰腺炎、心肌梗死和死亡率的风险,因此产品并未进入市场[8]。此外,有研究者尝试采用生物正交法交联两个Hb形成双四聚体以降低血管通透性,小鼠体内研究表明该双四聚体不会引起系统性高血压,表明其积极的临床潜力,然而其介导的氧化应激还有待使用豚鼠等其他动物模型研究[9]。

2.2.1.3 聚合型血红蛋白:血红蛋白与酶结合后,以交联剂连接相邻分子表面的氨基可生成分子质量不均一的多聚血红蛋白,增加四聚体的稳定性,延长血管内循环半衰期,提高携氧力和胶体渗透压,减少肾毒性和血管收缩作用。使用分子直径相似的小分子质量聚合牛血红蛋白和大分子质量聚合牛血红蛋白对豚鼠的毒性实验表明,聚合血红蛋白的分子质量大小决定了其输注引起的血管活性、循环时间、清除机制、毒性和炎性反应[10]。此外,针对低分子质量聚合血红蛋白(LMW PolyHb)存在的外渗、一氧化氮清除,导致血管收缩和高血压等问题,有研究通过将天然存在的Hb清除蛋白触珠蛋白与不含血红素的载脂血红蛋白的结合物预处理动物,缓解了输注LMW PolyHb引起的平均动脉压、心率、小动脉直径、血流量和功能性毛细血管密度变化,有助于减轻升压效应[11]。然而这些产品还需要进一步补充针对其他具有不同血管活性机制的动物模型的临床前研究。

2.2.2 细胞HBOCs:细胞HBOCs旨在模仿天然红细胞的一些基本特征以减少各种并发症的发生。目前主要有脂质体包裹的和纳米颗粒包裹的两类细胞HBOCs。

2.2.2.1 脂质体包裹的HBOCs:将纯化的Hb封装在由磷脂双分子层和胆固醇分子组成的稳定的脂质膜中,将无基质血红蛋白溶液和2,3-二磷酸甘油酯或肌醇六磷酸酯作为胶状液体包裹在一起。这种设计基本模拟Hb在红细胞中的生理状态,具有适当的氧饱和度和释放动力学。同时,脂质体包封Hb降低了对一氧化氮的清除作用,从而降低了对血管系统的不良影响;还可以防止肾小球清除Hb,减少肾毒性。使用聚乙二醇表面共轭脂质体包封Hb形成了Hb浓度与全血(～12 g/dL)相当的颗粒,并证实其不仅稳定性好而且具有理想的载氧功能[12]。这表明,脂质体包裹的HBOCs可以克服HBOCs的固有缺陷,保护内部环境免受外部影响,有望开发出更有潜力的人造血液产品应用于临床。

2.2.2.2 纳米颗粒包裹的HBOCs:将Hb与维持氧化还原环境、Hb稳定性和氧气/二氧化碳转运的酶封装在生物相容和可生物降解的纳米颗粒中,可以保持Hb与天然红细胞相似的氧运输能力,模拟其活动。但与脂质体相比,纳米颗粒的一个潜在问题是其更高的壳厚度可能导致封装的Hb或从Hb释放到组织的扩散时间更长,而聚合物的分子质量、壳层厚度会影响体系中氧的运输。可变形的混合肽脂质纳米颗粒Erythromer具有类似于红细胞的形状、形态和生物相容性,能够结合每颗Hb的有效载荷,对一氧化氮的消除和血管活性的影响小,其Ⅰ期临床试验已于2022年11月在日本获得批准。这种去溶剂自组装的使用避免了非特异性聚合的不确定性和低Hb含量以及脂质包裹的血红蛋白囊泡的大脂质负担,为HBOCs的发展指出了一条将治疗性氧载体的研究目标、临床需求及快速发展的纳米医学领域的技术相结合的道路。

2.3 全氟碳化合物

全氟碳化合物(perfluorocarbon,PFC)是氢原子完全被氟原子取代的一种碳氢化合物。PFC生化特性良好,感染风险小,对氧气和二氧化碳的溶解度很高,且溶解在PFC中的氧含量与氧压呈线性关系,可以为缺氧组织迅速而广泛地提供氧气[13]。同时,PFC尺寸小,易通过某些疾病中红细胞不能通过的闭塞血管。但PFC不溶于水,需要被合适的表面活性剂(如磷脂)严格乳化或生成纳米颗粒,才能悬浮在血液中。目前,正在开展基于PFC的人造血液及靶向治疗等系列临床研究,而全面评估PFC可能带来的不良反应并针对性地改进产品构成、配比及乳化方式是其走向临床应用的关键。

2.4 干细胞

造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是存在于血液和骨髓中的稀有细胞,具有多能性和自我更新的特性,能够生成完整的造血系统,产生成熟血细胞。从HSCs生成红细胞耗时长,并且数量少,很难扩大其规模。因此,研究者正探索除HSCs外的其他人类干细胞生成血细胞或产生血细胞成分的可行方法。

2.4.1 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs):ESCs来源哺乳动物胚胎早期发育阶段囊胚的内细胞团。人胚胎干细胞(human ESCs,hESCs)能够无限增殖,同时保持分化成包括血细胞在内的身体所有细胞的能力。开展ES CD34+细胞来源的红系细胞扩增受限和去核受损的相关机制研究,可能有助于改善干细胞的体外红细胞生成[14]。

2.4.2 诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs):iPSCs是通过反转录病毒转导特定因子将成年体细胞重编程而成的胚胎样细胞,具有自我更新和分化为多种类型细胞的能力。通过培养、扩增、重编程,在稀有血型献血者的外周血中获得iPSCs,之后又将其成功分化为红细胞前体细胞,并且无明显的染色体突变,且每个iPSCs的红细胞产量适中[15]。这证明了自体iPSCs分化的红细胞用于无替代选择的患者临床输血的潜在可行性。此外,针对iPSCs分化得到的红细胞存在分化程度和完全去核率低等问题,研究者也提出与巨噬细胞共培养以模拟红系造血岛(erythroblastic islands,EBI)等解决方案[16]。

2.4.3 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs):近年来,人毛囊来源的间充质干细胞因被证实具有诱导红细胞和iPSCs的潜力而备受关注。通过Oct4基因过表达并将其暴露在造血细胞因子中,可以将其诱导成为成熟的、主要表达成人β-珠蛋白链的红细胞,且这些红细胞几乎都不含细胞核[17]。这些发现表明,成熟的红细胞可以从成年体细胞中获得,MSCs分化的红细胞是潜在的自体输血的红细胞的替代来源。

3 人造血液的临床应用

目前,通过化学修饰、干细胞合成等方法,研究者们已设计出多种氧载体,可广泛应用于缺氧引起的疾病、伤口愈合、器官保护等各个领域。虽然这些氧载体在临床应用中仍有一定的局限性,但相比天然血液输血,运用人工氧载体具有不可替代的优势:与所有血型相容、感染风险低、可长期储存、适用于极端情况等。除此之外,动物和临床试验表明,根据不同疾病特点使用人工氧载体联合一氧化碳、光动力疗法等,可靶向快速治疗疾病,应用前景广阔。

3.1 人造血液在失血中的应用

3.1.1 产科大出血:通过在怀孕大出血休克母兔模型中对比不同复苏输注方法发现,仅用5%人血清白蛋白复苏输注及手术止血组动物全部在8 h内死亡,而采用红细胞组和脂质体包裹的HBOCs组动物则全部存活8 h以上[18]。这表明,脂质体包裹的HBOCs输注可恢复重要器官供氧,有望作为预防产科大出血休克的初步治疗方法。

3.1.2 出血性休克后的脑缺血/再灌注损伤:有研究使用一氧化碳结合的血红蛋白囊泡(co-bound hemoglobin-vesicle,CO-HbV)对失血性休克的大鼠进行复苏,结果表明,使用CO-HbV 14 d后不会导致明显的海马损伤,还可有效预防出血性休克后脑缺血再灌注损伤,为治疗出血性休克后脑缺血再灌注损伤提供了新途径[19]。

3.2 人造血液在恶性肿瘤中的应用

3.2.1 放射治疗:使用氟化透明质酸(fluorinated hyaluronic acid,FHA)封装氧气饱和PFC制备的肿瘤靶向氧饱和载体O2@PFC@FHA NPs可以将安全且特定的氧气输送到肿瘤中,其中FHA的封装不仅提高了肿瘤的靶向性,而且可以降低氧的释放速率,运载更多的氧气进入肿瘤缺氧区域,使对荷瘤小鼠的放射治疗疗效几乎增加了两倍,且无明显的全身毒性,具有应用于临床实体瘤治疗的潜力[20]。

3.2.2 靶向治疗:光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)利用光敏剂通过Ⅰ型和Ⅱ型过程产生的细胞毒性活性氧(reactive oxygen species,ROS)能有效杀灭细菌,不受细菌耐药性限制,然而治疗效率受感染部位缺氧限制。一种全氟化碳共轭的四氟苯基细菌绿素(perfluorocarbin-conjugated fetrafluorophenyl bacteriochlorin,FBC-F)的氧可调纳米平台能够高效地为Ⅱ型PDT生成单线态氧,并为I型PDT生成超氧阴离子和羟基自由基,显著提高体外抗菌效果,且动物实验表明FBC-F能高效杀菌并促进伤口愈合,为光动力抗菌治疗开辟了一条新途径[21]。类似地,有望作为非侵入性癌治疗方法的声动力疗法(SDT)疗效也受肿瘤缺氧限制。有研究利用硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、产生ROS的声敏剂rhein(Rh)和PFC构建了一种新型CD44受体靶向和氧化还原/超声响应载氧纳米平台CS-Rh-PFC,增加了黑色素瘤细胞中的氧含量并提高了SDT的效率,结合抗肿瘤药物多西他赛(docetaxel,DTX)实现了精确的肿瘤靶向药物释放,促进全身免疫和抗肿瘤疗效[22]。未来,新型纳米平台还可以通过同时包封多种药物或免疫佐剂及多功能声敏剂,进一步提高抗肿瘤效果。

3.2.3 免疫治疗:肿瘤免疫治疗通过主动或被动方式使机体产生肿瘤特异性免疫应答,具有特异高效、不良反应小等优点,但肿瘤缺氧的微环境会阻碍其治疗。体外和体内研究表明,PFC或Hb修饰的脂质体(PFC@lipo或Hb@lipo)能够有效负载和释放氧气,缓解肿瘤缺氧,且将更为安全、具有较高动物耐受性的Hb@lipo与PD-1抗体联合使用,显著增强了PD-1的抗肿瘤作用并抑制了4T1乳腺癌的进展,然而治疗CT26结肠癌时受高度浸润的M2巨噬细胞限制,疗效并不明显[23]。

3.3 人造血液在器官及灌注中的应用

3.3.1 器官保存液添加剂:M101是一种源自海洋沙蚕Arenicola marina的细胞外氧载体的治疗性氧载体。有研究在使用M101进行大鼠离体心脏灌注、猪肺同种异体移植等临床前研究表明,其在改善相关功能参数的基础上,首次使用M101作为人体肾移植保存液添加剂,受体没有出现与该产品相关的过敏或超敏反应或感染,且基本不会导致间质纤维化、肾小管萎缩和血管病程发展,没有毛细管血栓形成或微循环改变,这表明了M101具有良好的耐受性,验证了其作为器官保存液添加剂的安全性,并为进一步研究评估M101的成本/疗效比和长期效益提供了依据[24]。

3.3.2 灌流液:以人工胎盘生命支持系统为基础,使用脂质体包裹的HBOCs作为人工胎盘回路启动液,可以维持极度早产的绵羊胎儿生存长达72 h,展现了人造血产品在人工胎盘技术临床转化中的潜力[25]。

4 问题和展望

相比天然血液,人造血液具有便于长期储存、无致病菌、万能血型等优势,当前4类产品均尚有优化空间:人工合成血红蛋白可以通过定点诱变被特殊修饰而具有变构效应,但生产成本高,产量和纯度过低,难以满足大规模生产需求,需探索新的合成体系;HBOCs抗原性弱,生物相容性好,但半衰期较短且大剂量使用不良反应明显,需探索合适的修饰条件和封装方法;PFC携氧能力强,但稳定性差、不良反应未知,需针对性地改进构成、配比及乳化或生成纳米颗粒方式;干细胞分化所得红细胞虽为直接细胞来源,但无法满足临床输血量需求,还存在一定的致瘤风险,需改进培养和诱导分化的方法。

除用于基本的输血外,不同类型人造血液根据其特性,或与光动力疗法等治疗方法相结合,还可被推广应用到移植器官保护、心血管的缺氧性疾病、肿瘤的放疗和化疗等多种疾病的治疗中。例如,脱细胞HBOCs可以集修饰与靶向于一体,对病灶定向特异性供氧,使治疗更精准;饱和一氧化碳辅助治疗镰状红细胞贫血症;作为器官保存时的灌注液维持器官活力和细胞功能;联合一氧化氮等输注,逆转治疗中的肺动脉高压等情况,减轻不良反应。

人造血液应用前景广阔,而如何评价不同产品是未来人造血液重点研发方向选择及性能改进的必要前提。总的来看,来源、生产成本、生产工艺、稳定性和安全性是对人造血液产品的主要评价指标。然而,目前缺少一个统一而明确的评价体系评估人造血液产品性能。同时,受当前技术限制,各类人造血液还存在半衰期短、生产工艺复杂、费用高等问题,相关产品多还处于研发及临床试验阶段,获准上市的产品非常少,普遍缺乏动物实验数据,以验证其有效性以及安全性,且未实现批量生产和规模化推广应用。这些现实问题限制了人造血液的产品化及其临床应用转化。因此,亟需来自生物医学、血液学等各领域的专家以及适当的监管机构的协同努力,建立标准化的体外和体内评价指标,推进产品开发、动物实验、临床研究和工艺产业化,由此推动人造血液临床多领域推广应用。