胚胎植入前遗传学检测在Turner 综合征患者中的临床应用

陈智镖 ，黄秋香 ，毛丽华 ，陈国勇 ，刘 芸 ，王志红

（1）福建医科大学福总临床医学院（第九〇〇医院）妇产科生殖中心;2）基础医学实验室，福建 福州 350025）

Turner 综合征，又称为先天性卵巢发育不全综合征，是X 染色体完全或部分缺失以及结构异常所导致的性染色体疾病，是造成女性生殖困难最常见的染色体畸变类型[1]。在Turner 综合征患者中，大约50%为X 单体型（45，X），20%～30%为嵌合型（45，X/46，XX），其余多为另一条X 染色体结构异常[2]。据报道，Turner 综合征女性自然怀孕的几率仅为4%～7%，早期流产率高达30%～45%，后代伴畸形或染色体异常率达20%～50%[3]。2018 年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查专家共识》[4]对性染色体异常是否行胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）给予一定的建议，但文献报道不多。本研究回顾性分析选择行PGT 助孕的18 例Turner 患者的临床资料、胚胎发育情况、PGT 结果以及移植妊娠结局，探讨PGT 在Turner 患者中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016 年1 月至2023 年6 月在第九〇〇医院生殖中心行PGT 助孕的18 例Turner 综合征患者。所有夫妇均经过遗传咨询并签署PGT 知情同意书。本PGT 项目经卫生行政部门审批并经医院伦理委员会批准开展（2 013 027）。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎体外受精、培养和活检根据患者临床基础情况选择相应超促排卵方案。采用常规体外受精或卵胞浆内单精子显微注射授精，转移至G1（Vitrolife，瑞士）微滴培养，16～18 h 观察记录受精情况。取卵后D3 观察卵裂情况，将原核（pronucleus，PN）为2PN 或0PN 或1PN 的卵裂胚转入G2（Vitrolife，瑞士）微滴进行囊胚培养。至D5/D6/D7，对可行活检囊胚参照文献[5]操作，活检5～10 个滋养层细胞。活检过的囊胚行玻璃化冷冻保存。

1.2.2 PGT 流程对于核型为45，X 的患者和X染色体结构异常的患者，PGT 采用NGS 技术。活检细胞采用多次退火环状循环扩增技术（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）进行全基因组扩增（whole genome amplification，WGA），扩增产物使用Hiseq2500（Illumina，美国）测序，检测胚胎23 对染色体，筛除非整倍体及拷贝数变异4 Mb 以上缺失或重复的胚胎。X 染色体结构异常患者的胚胎检测范围同上述，如果异常片段小于1 Mb 则同时进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）连锁分析。

对于嵌合型Turner 综合征患者，PGT 采用微阵列-比较基因组杂交技术（microarray comparative genomic hybridization，a-CGH）。活检细胞采用PicoPlex 法（DNA Amplification Kit，Takara，日本）进行WGA，扩增产物使用GenetiSure 芯片（Agilent，美国）进行检测，检测胚胎23 对染色体，筛除非整倍体及拷贝数变异10 Mb 以上缺失或重复的胚胎。

1.2.3 胚胎移植与随访根据PGT 结果，择期选择可移植胚胎进行解冻移植。移植后14 d 检测尿及血HCG，35 d B 超可观察到妊娠囊，即可确认为临床妊娠。妊娠18～24 周行羊水穿刺产前诊断，并随访临床结局。

2 结果

2.1 临床资料

18 例患者年龄24～40 岁，其中核型45，X患者2 例，嵌合45，X 患者11 例（包括45，X/46，XX 患者9 例；45，X/47，XXX 患者1 例；45，X/47，XXX/46，XX 患者1 例），X 染色体结构异常患者5 例，见表1。

表1 患者的核型和基本资料Tab.1 Karyotype and basic information of the patients

18 例患者中病例2、6 和8 的抗苗勒管激素（anti-M ü llerian hormone，AMH）水平低，均小于1.1 ng/mL；病例13 的窦卵泡数（antral follicle count，AFC）少于5 个，见表1。

18 例患者中有12 例为继发不育：病例15 无流产史，病例6 和7 因胎儿畸形而引产，其余病例均因胚胎停育而流产。病例5、7、15、16 和17 均有分娩史，除病例7 早顺产1 男婴不明原因夭折外，4 例患者分娩4 个健康新生儿（3 女1 男），患者主诉均体健，但未查染色体，见表1。

2.2 超促排卵与胚胎发育

18 例患者共进行了24 个取卵周期，以拮抗剂方案为主，卵泡生长未见明显异常，但在获卵方面，病例1、4、7 和12 均较差，获卵率不超过50%。病例4 的第2 个周期因无成熟卵未行ICSI 授精，而病例6 获卵3 个，仅1 个成熟卵。病例4（第3 个周期）以及病例6 的成熟卵经ICSI授精后，均未受精。胚胎发育方面，除6 例患者（病例1～6）外，余12 例均有形成可活检囊胚，见表2。

表2 患者的胚胎发育情况Tab.2 Embryonic development

2.3 PGT 结果

12 例患者共活检61 个胚胎：全基因组扩增失败1 个，明确诊断60 个。其中整倍体胚胎29 个，染色体异常胚胎25 个，嵌合体胚胎6 个，染色体异常率达41.7%。

6 例患者胚胎染色体异常率均超过50%，分别为病例7、8、13、14、17 和18。25 个染色体异常胚胎中，性染色体异常胚胎仅有2 个，分别为携带母源X 染色体结构异常和X 染色体单体，常染色体则以1 号、5 号、16 号和22 号染色体异常为多见，见表3。

表3 染色体异常胚胎具体情况Tab.3 The details of chromosomal abnormal embryos

2.4 临床结局

截止2023 年6 月30 日，12 例行PGT 患者中，有1 例患者无可移植胚胎，3 例患者有可移植胚胎但未解冻移植，8 例患者进行了9 个周期的单囊胚解冻移植，7 例（7/9，77.8%）获临床妊娠，其中4 例已分娩4 个健康男婴，3 例持续妊娠中，见表4。

表4 胚胎移植及妊娠结局Tab.4 Embryo transfer and pregnancy outcomes

3 讨论

3.1 Turner 综合征患者的临床特征

Turner 综合征的染色体核型种类较多，患者临床表型复杂[3，6]。核型表型间缺乏显著的相关性，对于有生育要求的Turner 患者应结合具体临床病史，综合分析核型、卵巢储备能力等，进行详细的筛查和咨询。本研究18 例患者以嵌合型Turner 为主，均无性腺发育不良；1 例出现肘外翻的特殊躯体特征；有7 例身材矮小，其中病例6 和7 患者存在决定身高的Xp11-22 区域[7]范围内缺失；有4 例患者AMH 水平或AFC 检查，均提示存在POI[8]，其他患者则无典型的POI 症状，这可能是因为缺失的X 染色体出现失活偏离，从而导致其表型正常[9]，或者是因为外周血的异常细胞比例不一定代表其他组织细胞的真实情况，因而外周血核型嵌合比例不能完全预测表型[10]。研究表明，核型为45，X 的Turner 患者是有可能自然受孕的，嵌合型和自发月经初潮的患者自然受孕的可能性更高[11]，但是Turner 患者自发妊娠后不良妊娠结局发生率较高[3]。本研究12 例患者有妊娠史，包括1 例核型45，X 的Turner 患者和11 例嵌合型Turner 患者，共27 次妊娠，自然流产19 次，与上述研究报道相似。

3.2 Turner 综合征患者胚胎的染色体异常情况

随着年龄的增长，Turner 患者的卵巢储备能力迅速降低，自发妊娠的可能性下降，辅助生殖技术成为有生育要求的Turner 患者妊娠的途径之一。鉴于Turner 患者有可能生育染色体异常患儿，目前多数学者建议Turner 患者选择PGT 助孕治疗[12-14]，但也有学者持相反观点[15]。在辅助生殖技术中以女方年龄≥38 岁为高龄。本研究18 例患者有年轻患者也有高龄患者，但卵巢功能均尚未衰竭，结合病史，在经过详细的筛查和咨询，所有患者均选择尝试自卵PGT 助孕。促排卵后少数患者的获卵数和成熟卵数并不理想，可能是由于Turner 患者与高发生率的卵成熟障碍引起的[16]。核型45，X 的Turner 患者大多数无生育力，选择接受赠卵治疗，目前仅Li 等[15]报道1 例29 岁女性通过自卵PGT 助孕获得1 枚整倍体胚胎。本研究2 例核型45，X 的Turner 患者均无活检胚胎形成，与Liao 等[13]的报道一致，仅1 例X 染色体结构异常患者和11 例嵌合Turner 患者有可活检囊胚形成。活检胚胎PGT 结果显示，染色体异常率41.7%，略低于Li 等[15]报道的46.82%。另外，本研究有5 例患者胚胎染色体异常率超过50%，其中4 例为45，X/46，XX 患者，包括1 例高龄（≥38 岁）但低嵌合比例（≤10%）的患者、2 例年轻（＜38 岁）但高嵌合比例（＞10%）的患者和1 例高龄合并高嵌合比例患者，1 例为高龄合并45，X/47，XXX/46，XX 患者，与Li 等[14]认为对胚胎影响更严重的是女性年龄，而不是X 染色体异常的观点似乎不完全一致，这可能与笔者的病例数较少而缺乏数据支持有关。但有趣的是，笔者同样发现X 染色体在胚胎中畸变频率并不高，相反地，常染色体以16 号和22 号染色体异常更为常见。这可能是由于16 号和22 号染色体更易受减数分裂错误的影响以及胚胎发生过程中对这些常染色体异常有更高的耐受性引起的[15]。

3.3 Turner 综合征患者行PGT 助孕后的临床结局

本研究8 例嵌合Turner 患者，其中4 例为年轻但高嵌合比例的患者，4 例为或高龄或复发流产或男方因素合并低嵌合比例的患者，进行9 个单囊胚解冻移植周期。除1 例年轻但高嵌合比例的患者未获妊娠外，其余患者均获临床妊娠：有4 例已分娩4 个健康男婴，产前诊断检测核型3个正常，1 个新发染色体平衡易位，另外3 例持续妊娠中。以上结果提示嵌合型Turner 患者，高嵌合比例患者或合并其他PGT 适应症的低嵌合比例患者，通过PGT 选择可移植胚胎，可获得良好的妊娠结局，与Liao 等[12-14]学者的观点一致。

综上所述，Turner 综合征染色体核型种类较多，患者临床表型各不相同，辅助生殖助孕前应进行详细的评估与咨询，充分告知PGT 助孕预后差异较大。对于有活检胚胎的Turner 患者，通过PGT 能有效筛选可用胚胎，获得理想的临床结局。