Mertk 介导NF-κb 通路影响雪旺细胞炎症反应的作用

付怡丹 ，陈文婷 ，苏晓杨 ，赵 燕 ，兰丹凤 ，杨秋萍

（1）昆明医科大学第一附属医院干疗科;2）重症医学科;3）糖尿病科，云南 昆明 650032;4）云南省第一人民医院消化内科，云南昆明 650032;5）昆明医科大学第一附属医院内分泌一科，云南 昆明 650032）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的并发症之一，国内患病率达67.6%，其中重度 DPN 患病率达19.3%[1]。雪旺细胞作为周围神经系统中最重要的髓鞘细胞，参与维持周围神经的正常结构和功能[2-3]，炎症反应对雪旺细胞的损伤是DPN 发生发展的重要因素[4]。核因子κB（nuclear factor kappa-b，NF-κb）级联反应是炎症反应的调控中心，抑制NF-κb 通路，有望降低炎性细胞因子的表达，最终改善神经损伤[5]。

Mer 受体酪氨酸激酶（Mer receptertyroshin kinase，Mertk）是受体酪氨酸激酶家族TAM 成员之一，作为一种单跨膜受体可以通过结合多种配体将信号从细胞外基质转导至细胞质，调节众多生理过程[6-8]。现有文献显示[9-10]，Mertk 能够抑制促炎性细胞因子IL-12、干扰素和NF-κb 的表达，从而抑制炎症信号转导。本课题前期利用公共数据库，发现并报道[11]Mertk 基因表现出糖尿病周围神经病变的疾病特异性，但Mertk 在雪旺细胞中的可能作用及其调控机制尚不清楚。为此，本研究通过沉默大鼠雪旺细胞内Mertk 基因，探究Mertk 是否通过调控炎症反应NF-κb 通路相关蛋白B 细胞κ 轻肽基因增强子抑制因子激酶ε（inhibitor kappa B kinaseβ，Ikbkb）、P65、TNFα，从而影响雪旺细胞炎症反应。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

AI1600 超灵敏化学发光成像仪（GE 公司，美国）和正置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）来源于昆明医科大学科技成果孵化中心，垂直电泳及湿式转膜系统购自北京六一生物科技公司。葡萄糖浓度为4.5 g/L（25 mmol/L）的DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液均购自美国GIBCO 公司，无水葡萄糖购自广州光华科技有限公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，Mertk、Ikbkb抗体购自美国Abcam 公司，P65 抗体、TNF-α抗体、β-actin 抗体、IgG 抗体、抗兔/抗鼠第二抗体购自武汉Proteintech 公司，免疫荧光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，免疫共沉淀试剂盒购自上海爱必信科技有限公司。

1.2 细胞培养

大鼠雪旺氏细胞株（RSC96）来自昆明医科大学科技成果孵化中心，生长所需细胞培养基配比是DMEM 培养基∶胎牛血清∶双抗=100∶10∶1，放置在37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。

1.3 Mertk 在高糖环境雪旺细胞中表达

将RSC96 细胞随机分为对照组（25 mmol/L 组）和处理组（50、75、100 及125 mmol/L 组）。首先使用不添加胎牛血清的培养基进行饥饿处理4 h，再将DMEM 培养基中葡萄糖浓度分别调整至50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L 及125 mmol/L，继续培养48 h，Western blot 检测细胞内Mertk 蛋白表达水平。

1.4 免疫共沉淀检测内源性Mertk、Ikbkb 相互作用

培养3 瓶RSC96 细胞。以Lysis buffer∶PMSF=100∶1 配制裂解液，将RSC96 细胞裂解、超声、离心、留取Input 蛋白，所得产物分别加入Mertk、Ikbkb、IgG 一抗1～5 µg，4℃孵育过夜后加入5 µL Protein A 与Protein G，再经过孵育、洗涤、离心、SDS 缓冲液重悬、变性得到终产物，最后利用免疫印迹法检测Mertk 与Ikbkb 的相互作用。

1.5 免疫印迹法检测沉默Mertk 后RSC96 内Ikbkb、P65、TNF-α 表达水平

将3 种Mertk siRNA 试剂（siRNA1/siRNA2/siRNA3）及空载对照（NC）利用GP-Transfect-Mate试剂转染进入RSC96 细胞。48 h 后根据BCA 试剂盒说明书所述提取总蛋白，免疫印迹法检测Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α 表达水平。siRNA核苷酸序列见表1。

表1 Mertk 小干扰核苷酸序列Tab.1 Mertk-RNA oligo sequences

1.6 免疫荧光法检测沉默Mertk 后炎症因子TNFα 表达

在玻璃爬片上培养RSC96 细胞，随机分为对照组（Con 组）和实验组（siRNA3 组），按组别处理细胞。48 h 后细胞经过固定、通透、封闭等步骤后，分别加入Mertk（1∶200）、Ikbkb（1∶200）、P65（1∶200）一抗4℃孵育过夜，第2 天加入相对应种属的荧光二抗暗室内孵育；DAPI 染细胞核10 min 后，将细胞爬片倒扣在滴有荧光淬灭剂的载玻片上，使用正置荧光显微镜观察并拍照。

1.7 统计学处理

采用SPSS23.0 统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov 法检验数据正态性，符合正态分布时以均数±标准差（）表示，多组间单因素比较采用单因素方差分析。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mertk 在雪旺细胞的表达

首先明确Mertk 在雪旺细胞中是否表达，以及模拟糖尿病高糖环境下Mertk 表达水平的变化情况。免疫印迹结果显示，Mertk 在雪旺细胞中存在表达，且随葡萄糖浓度增加，细胞Mertk 表达水平增加（P＜ 0.05），见表2 和图1。

图1 不同葡萄糖水平RSC96 内Mertk 蛋白表达Fig.1 Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels

表2 不同葡萄糖水平RSC96 内Mertk 蛋白表达Tab.2 Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels

2.2 Mertk 与Ikbkb 内源性相互作用

以非特异免疫的同源抗体IgG 作为阴性对照，以Input 作为阳性对照，免疫共沉淀结果显示，RSC96 细胞内同时表达Mertk、Ikbkb，且二者之间存在相互作用关系，见图2。

图2 Mertk 与Ikbkb 免疫共沉淀Fig.2 Co-Immunoprecipitation of Mertk with Ikbkb

2.3 沉默Mertk 对雪旺细胞Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表达的影响

免疫印迹实验结果显示，3 种siRNA 均使Mertk 表达含量下降（P＜ 0.05），同时Ikbkb、P65、TNF-α 表达水平随Mertk 表达水平的降低而升高（P＜ 0.05），见表3 和图3。

图3 沉默Mertk 后Ikbkb、P65、TNF-α 蛋白表达水平Fig.3 Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression levels after silencing Mertk

表3 沉默Mertk 后Ikbkb、P65、TNF-α 蛋白表达量Tab.3 Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression after silencing Mertk

2.4 免疫荧光检测Mertk、Ikbkb、P65 蛋白

以siRNA3 转染RSC96 细胞后，Mertk、Ikbkb、P65 蛋白免疫荧光结果与免疫印迹实验一致，见图4。

图4 免疫荧光检测siRNA3 转染后Mertk、Ikbkb、P65 蛋白表达（200x）Fig.4 Immunofluorescence detection of Mertk，Ikbkb，and P65 protein expression after siRNA3 transfection（200x）

3 讨论

糖尿病周围神经病是糖尿病患者最常见的慢性并发症，是导致糖尿病患者截肢，生活质量下降及死亡的主要原因之一，加重社会负担[12]。糖尿病周围神经病变以神经纤维脱髓鞘、神经传导速度受损为特征[13]，而雪旺细胞正是周围神经系统中最重要的髓鞘细胞；雪旺细胞损伤与凋亡是糖尿病周围神经病变的重要病理学特征之一，也是导致糖尿病髓鞘功能不良的主要因素[14]。因此，本研究以大鼠雪旺细胞作为研究对象，以此作为糖尿病周围神经病变研究的重要切入点，并且首先明确了Mertk 在雪旺细胞中的表达，即随着细胞生长环境内葡萄糖浓度的提高，Mertk 表达量也随之提高。

蛋白质通常不是作为单一物质发挥作用，而是以蛋白质-蛋白质相互作用的方式在活细胞生物过程中发挥作用。本研究结果通过免疫共沉淀实验，验证了雪旺细胞内Mertk 与Ikbkb 的内源性相互作用。Ikbkb（也称IKKβ、IKK2）是IKK 复合体的催化亚基之一，而IKK 复合体是NF-κb信号转导通路的关键调节因子，可迅速激活NFκb，以协调大多数靶基因的表达[15-16]。因此，本实验试图进一步探究Mertk 是否间接调控NFκb 通路，对雪旺细胞炎症反应产生影响。

为达到这一目的，本研究使用siRNA 敲减沉默表达Mertk 后，发现P65 及其下游炎症因子TNF-α 表达水平升高，表明NF-κb 通路受到正向调控，雪旺细胞内炎症反应加重。经典的NFκb 系统是由亚基p50 和P65 组成的复合体，在大多数静息细胞中，NF-κb 以抑制物IκB 的形式存在。糖尿病病理过程产生的刺激，可导致IKK 特异性地磷酸化IκB，进而允许p50 和P65向细胞核发出信号，激活大量有关基因[17]。NFκb 通路调控的促炎细胞因子是神经血管损伤和神经传导速度受损的主要原因，抑制NF-κb 通路，有望降低炎性细胞因子的表达，最终改善神经损伤[5]。由此，课题组推测，以Mertk 基因为靶点进行研究可能为糖尿病周围神经病的治疗提供新的思路。

综上所述，本研究以雪旺细胞为研究对象，发现Mertk 与Ikbkb 相互作用，沉默Mertk 可上调Ikbkb，继而激活NF-κb 信号转导通路，上调P65 及其下游炎症因子TNF-α 表达水平。本研究对糖尿病周围神经病变的发病机制、临床药物的治疗、靶向药物的研发都有非常积极的作用，这些体外细胞实验也为进一步的动物体内实验以及临床血清分子标记验证打下了基础。