玫瑰石斛的化学成分及其生物活性

庄晨曦 ，王慧敏 ，陈亚萍 ，张 锐 ，郑金蓉 ，李美红 ，李玉鹏

（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500;2）红河卫生职业学院药学院，云南 红河 661100;3）昆明医科大学现代生物医药产业学院，云南 昆明 650500;4）云南传染病医院药剂科，云南 昆明 650301）

玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）主要分布于云南南部至西南部[1]。文献报道[2]，玫瑰石斛对口干烦渴、阴伤津亏、病后虚热、食欲不振有利，蕴含较高的保健价值，除此之外，其花大而鲜艳，极具观赏价值。野生玫瑰石斛资源由于长期过度采收，近年来已大量减少，甚至在有些地区已濒临灭绝[3]。因此，作好玫瑰石斛的栽培、化学成分和生物活性研究十分重要。

1 材料与方法

1.1 材料

核磁共振波谱仪为AVANCE-400/AVANCE-600 型；柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产；葡聚糖凝胶（安发玛西亚生物技术公司，粒径40～70 µm）；RP-18 柱色谱材料；所有有机溶剂均为工业纯，经重蒸后备用。10%硫酸乙醇溶液为显色剂，A549、MCF-7/S、SKOV-3 肿瘤细胞株。

1.2 植物来源

本实验所用玫瑰石斛样品于2017 年9 月采自云南省保山龙陵石斛种植基地，经鉴定为玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）的全草，标本（No.20170917）。

1.3 研究方法

1.3.1 提取与分离方法云南玫瑰石斛干燥全草（3.30 kg），用有机溶剂甲醇提取，得到总浸膏（53.0 g），所得浸膏用水分散后不同溶剂萃取，得到石油醚萃取部分（15.1 g），乙酸乙酯萃取部分（25.3 g）。从石油醚提取部分得到化合物1～5，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析、反相柱层析和凝胶柱层析，得到化合物6～9。

石油醚萃取部分，经氯仿溶剂溶解，80～100 目的硅胶拌样，经混合溶剂石油醚-丙酮（20∶1～0∶1）梯度洗脱，得到5 个亚组分（Fr.AFr.F）。化合物5（120 mg）在亚组分Fr.E（1.7 g）中以白色针状晶体析出，经过滤分离得到。亚组分Fr.C（2.3 g）经硅胶石油醚-乙酸乙酯（20∶1～5∶1）溶剂系统洗脱，Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱纯化，洗脱剂为甲醇-氯仿（20∶1），得到化合物1（5.3 mg）和化合物2（3.1 mg）。亚组分Fr.B（3.1 g）经硅胶柱层析，石油醚-丙酮（25∶1～0∶1）溶剂系统洗脱，Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱纯化，洗脱剂为甲醇-氯仿（20∶1），得到化合物3（4.3 mg）和化合物4（13.1 mg）。

乙酸乙酯部分经丙酮溶解，以80～100 目硅胶拌样，经 200～300 目硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-丙酮（9∶1～0∶1），混合溶剂梯度洗脱，合并相同流分得5 个组分（Fr.A～Fr.E）。

组分Fr.A（5.3 g）经硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-丙酮（20∶1～0∶1），经混合溶剂洗脱，得到3 个亚组分（Fr.A1～ Fr.A3）。亚组分Fr.A2（1.5 g），经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮（25∶1～5∶1）进行洗脱，得到化合物 8（5.6 mg）和化合物9（8.9 mg）。亚组分Fr.A3（0.21 g），经凝胶柱层析和反相柱层析，得到化合物6（3.8 mg）和化合物7（7.3 mg）。

1.3.2 化合物的抗肿瘤活性筛选方法化合物5～9 对3 种肿瘤细胞株（A549、MCF-7/S、SKOV-3）抑制活性筛选方法为MTT 法[4]。

1.4 统计学处理

采用 Microsoft Excel 2010 软件计算抑制率，运用IBM SPSS Statistics 24 统计学软件计算化合物的半数抑制浓度IC50。

2 结果

2.1 化合物波谱数据

2.1.1 化合物 1 p-hydroxybenzaldehyde无色油状物。MF: C7H6O2，MW: 122;1H NMR [CD3OD，600 MHz]:δ9.76（1H，s，H-7），7.79（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.93（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5）;13C NMR[CD3OD，150 MHz）δ191.69（s，C-7），115.54（d，C-3，5），132.14（d，C-2，6），163.77（s，C-4），127.68（s，C-1）[5]。

2.1.2 化合物2 p-methoxyphenol黄色粉末，MF:C7H8O2，MW: 124;1H NMR [（CD3）2CO，600 MHz]δ3.85（3H，s，4-OCH3），6.74（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.96（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），7.78（1H，s，1-OH）[6]。

2.1.3 化合物3 p-Hydroxybenzyl alcohol黄色粉末，MF: C7H8O2，MW: 124;1H NMR [（CD3）2CO，600 MHz]:δ4.52（2H，s，H-7），6.78（2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6），7.17（2H，d，J=8.2 Hz，H-3，5）;13C NMR[（CD3）2CO，150 MHz]:δ63.76（t，C-7），128.38（d，C-3，5），114.96（d，C-2，6），133.05（s，C-4），156.49（s，C-1）[7]。

2.1.4 化合物4 hydroquinone黄色粉末，MF:C6H6O2，MW: 110;1H NMR [CD3OD，600 MHz]:δ8.22（1H，s，1-OH），7.07（2H，d，J=9.0 Hz，H-2，6），6.95（2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5），4.02（1H，s，4-OH）[8]。

2.1.5 化合物 5 （24R）-ethylcholest-5-en-3-ol-7-one白色针状晶体，MF: C29H48O2，MW: 432;1HNMR [600 MHz，CDCl3]: δ 0.75（3H，s，H-18），0.78（3H，s，H-19），0.79（3H，s，H-29），0.82（3H，d，J=6.7，H-21），0.83（3H，d，J=6.5，H-27），0.86（3H，d，J=6.5，H-26），2.40（2H，m，H-15），2.47（2H，m，H-12），2.48（1H，m，H-28 α），2.51（2H，m，H-23），2.52（2H，m，H-16），2.55（1H，m，H-20），2.56（1H，m，H-11 α），2.45（1H，m，H-28β），2.57（2H，m，H-22），2.57（1H，m，H-11β），2.64（1H，m，H-25），2.81（1H，m，H-2 α），3.19（1H，m，H-2β），3.56（1H，m，H-3），3.79（1H，s，H-7），5.80（1H，d，J=5.1，H-6）.13C NMR [CDCl3，600 MHz]:δ36.12（t，C-1），31.87（t，C-2），65.01（d，C-3），39.63（t，C-4），146.51（s，C-5），126.28（d，C-6），64.02（d，C-7），36.12（d，C-8），53.62（d，C-9），38.00（s，C-10），20.98（t，C-11），42.51（t，C-12），42.50（s，C-13），55.89（d，C-14），24.16（t，C-15），29.15（t，C-16），55.89（d，C-17），12.20（q，C-18），18.73（q，C-19），36.12（d，C-20），19.03（q，C-21），34.26（t，C-22），24.15（t，C-23），53.63（d，C-24），29.14（t，C-25），20.97（q，C-26），19.49（q，C-27），23.06（t，C-28），12.25（q，C-29）[9]。

2.1.6 化合物 6 sinalexin黄棕色固体，MF:C10H8N2oS，MW: 204;1HNMR [CD3OD，600 MHz]:δ8.67（1H，s，H-1 ′），7.79（1H，m，H-4），7.27（1H，m，H-5），7.43（1H，m，H-6），7.55（1H，m，H-7），4.13（3H，s，1-OCH3）;13CNMR[CD3OD，150 MHz]:δ147.51（d，C-1 ′），156.53（s，C-2），124.86（s，C-3），121.13（d，C-4），120.19（d，C-5），124.86（d，C-6），109.43（s，C-7），138.30（s，C-3a），130.57（s，C-7a），58.86（q，1-OCH3）[10-11]。

2.1.7 化合物7 bis（2-ethylhexyl）benzene-1，2-dicarboxylate黄色油状物。MF: C24H38O4，MW:390;ESI-MS: 391 [M+H]+;1HNMR [CDCl3，600 MHz]:δ7.76（2H，d，J=7.8，H-3，6），7.65（2H，d，J=7.8，H-4，5），4.06（4H，t，J=6.7，H-1 ′），1.68（2H，m，H-2 ′），1.46（4H，m，2 ′-CH2CH3），1.43（4H，m，H-5 ′），1.42（4H，m，H-3 ′），1.41（4H，m，H-4 ′），0.95（6H，t，J=7.3，2 ′-CH2CH3），0.90（6H，t，J=7.2，H-6 ′）;13CNMR [CDCl3，150 MHz]:δ167.15（s，-COO-），131.15（s，C-1，2），132.51（d，C-3，6），128.75（d，C-4，5），67.45（t，C-1 ′），38.77（d，C-2 ′），30.28（t，C-3 ′），27.61（t，C-4 ′），23.61（t，2 ′-CH2CH3），22.75（t，C-5 ′），13.43（q，C-6 ′），10.42（q，2 ′-CH2CH3）[12]。

2.1.8 化合物 8 pinoresinol棕色油状物，C20H22O6，1H NMR（CD3OD，600 MHz）:δ7.52（2H，s，4 ′-OH，4 ′′-OH），6.99（2H，s，H-2 ′，H-2 ′′），6.83（2H，d，J=8.2 Hz，H-6 ′，H-6 ′′），6.78（2H，d，J=8.2 Hz，H-5 ′，H-H-5 ′′），4.67（2H，d，J=4.2 Hz，H-2，H-6），4.21（2H，dd，J=9.6，7.2 Hz，Hb-4，H-8），3.84（6H，s，3 ′，3 ′′-OCH3），3.80（2H，dd，J=9.6，5.4 Hz，Ha-4，H-8），3.06（2H，m，H-1，H-5）.13C NMR（CD3OD，150 MHz）:δC148.32（s，C-3 ′，C-3 ′′），146.84（s，C-4 ′，C-4 ′′），134.15（s，C-1 ′，C-1 ′′），119.60（d，C-6 ′，C-6 ′′），115.52（d，C-5 ′，C-5 ′′），110.56（d，C-2 ′，C-2 ′′），55.23（d，C-1，C-5），86.63（d，C-2，C-6），72.04（t，C-4，C-8），56.23（d，C-3 ′-OCH3，C-3 ′′-OCH3）[13]。

2.1.9 化合物9 Chaenomin B黄色油状物，分子式为 C25H25O8。MW: 453;15% H2SO4乙醇显色为紫色，与该化合物标准品进行TLC 对照，在多种溶剂系统中Rf值均相同。

2.2 化合物5～9 对3 种肿瘤细胞株抑制活性筛选IC50（µM）

化合物5～9 对3 种肿瘤细胞株A549、MCF-7/S、SKOV-3 抑制活性结果，见表1。发现化合物9 对A549 细胞株显示了较好的抑制活性，其IC50为29.35 µM，其作用略弱于阳性对照品DDP。

表1 化合物5～9 对3 种细胞株的细胞毒活性IC50（µM）Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 5～9 on three cell lines IC50（µM）

3 讨论

从玫瑰石斛分离鉴定得到9 个化合物，分别为p-hydroxybenzaldehyde（1），p-methoxyphenol（2），p-Hydroxybenzyl alcohol（3），hydroquinone（4），（24R）-ethylcholest-5-en-3-ol-7-one（5），sinalexin（6），bis（2-ethylhexyl）benzene-1，2-dicarboxylate（7），pinoresinol（8），Chaenomin B（9），化合物5～9 抗肿瘤活性测试结果表明，化合物9 对A549 细胞株显示了较好的抑制活性。化合物1～5，7，8 为首次从本植物中分离得到，化合物6，9 为首次从本属植物中分离得到，9 对A549 细胞株IC50为29.35 µM。

药理研究报道，玫瑰石斛能够在一定程度上抑制炎症的形成和发展。国内学者从玫瑰石斛得到一对外消旋二聚体（±）HomocrepidineA 和1 种哌啶类生物碱HomocrepidineB，利用甲苯诱导创建小鼠耳肿胀模型，证实了上述物质的抗炎作用[14]。进一步研究发现，玫瑰石斛所含总生物碱（Total alkaloids）可对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）产生抑制作用，并对LPS 引起的小鼠急性肺损伤提供保护作用，深入的化学分析结果显示，吲哚嗪类化合物是玫瑰石斛抗炎功效的来源[15]。对玫瑰石斛素的生物活性进行了研究，并证明其在实验中显示较强体外活性，可对抗由LPS 引起的小鼠急性肺损伤[16]。张朝凤等[17]发现，玫瑰石斛总生物碱具有良好的抗炎活性。笔者对玫瑰石斛的化学和生物活性研究对该植物的利用开发提供了物质基础。国内外学者对该属植物进行化学和药理活性研究，李燕等[18]从铁皮石斛得到2个联苄类化合物4，4，′-二羟基-3，5-二甲氧基联苄和4，4′-二羟基-3，3′，5-二甲氧基联苄，化合物1 表现出对 A2780 细胞毒活性（IC50=4.45 µM），化合2 表现出对A2780 细胞毒活性（IC50=1.41 µM），化合物还显示出对BGC-823 的弱细胞毒活性，IC50值为 2.82 µM。Sopanya等[19]发现Gigantol 具有抑制非小细胞肺癌细胞的迁移作用；Klongkumnuankarn 等[20]发现该化合物不仅具有细胞毒性，还具有抗迁移活性；陈欢欢等[21]发现石斛酚确实具有抑制人肝癌细胞HepG2 的生长并诱导其凋亡的作用，并且通过调节PI3K-Akt 信号通路诱导HepG2 生长抑制及细胞的凋亡。