220份四川小麦条锈病抗性鉴定与评价

张海鹏，叶雪玲，管方念，黄林玉，李 伟，邓 梅，魏育明，蒋云峰，陈国跃*

（1.四川农业大学小麦研究所，成都 611130；2.西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室，成都 611130；3.成都大学，成都 610106；4.四川农业大学农学院，成都 611130）

由小麦专化型条形柄锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici,Pst）引起的小麦（TriticumaestivumL.）条锈病是我国小麦生产上最重要的病害之一，其流行频率高、发病范围广且危害程度大，严重威胁着我国粮食安全。自1950—2020年间，分别在1950、1964、1990、2002 和2017年共发生5 次全国性的小麦条锈病大流行。其间，还有多次中等及以下程度或个别麦区条锈病偏重流行。近期如2020年全国小麦条锈病中度流行，在包括陕、鄂、豫南麦区在内的11 个省区偏重发生，据统计，当年全国发病面积439.52 hm2，造成小麦减产2.49 亿kg[1-3]。纵观我国小麦条锈病历次大流行的历史，造成小麦条锈病大流行的主要原因是新的条锈菌毒性小种发展为优势小种、主栽品种抗病性丧失抗性、感病品种大面积种植。近年来，随着强毒性条锈菌生理小种条中34号（CYR34）的出现及流行频率的逐年增高，导致以川麦42、贵农21和南农92R作为骨干亲本的抗源（Yr10、Yr24/Yr26/YrCH42）丧失抗性，标志着小麦生产上又一次品种更替的开始[4-5]。迄今为止，已有86个抗条锈病基因（Yr1-Yr86）被正式命名，另外还有100 余个临时命名基因和超过300 个控制小麦抗条锈病QTLs 被定位[6-10]，但仅有少数主效抗性基因或QTL 被实际应用于小麦抗病育种[4,11]。在国际正式命名的Yr基因中，目前在小麦生产上仅Yr5、Yr15和Yr61等少数全生育期抗性基因对我国小麦条锈菌流行小种或致病类群表现良好抗性。品种抗病性丧失既是一个重大科学问题，也是一个亟待解决的生产实际问题[12]。因此，针对当前小麦生产上流行的条锈菌生理小种或致病类群，明确小麦种质资源抗性水平及抗性基因布局，为育种家提供有效抗源并对高效、合理、可持续性利用小麦条锈病抗性，在生产上为实现多基因布局提供参考。四川作为西南麦区小麦种植面积最大的麦区，是我国小麦条锈菌最重要的秋季、春季菌源区及春季流行区之一，也是我国小麦条锈菌最关键的易变区和新小种策源地之一。因此，控制四川麦区条锈病的发生和流行成为保障我国西南，乃至全国小麦安全生产的关键。

本研究拟利用当前四川麦区小麦生产上条锈病流行强毒性优势小种CYR34 及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7 和G22-14 组成的混合生理小种对220 份四川小麦（包括150 份1997—2016年间育成品种、70 份农家种）分别进行室内苗期和田间成株期条锈病抗性表型鉴定；同时，结合已知条锈病抗性基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr24/26、Yr41和Yr48紧密连锁或功能标记进行分子检测，明确四川小麦对当前流行条锈病生理小种或致病类群的抗性水平和抗条锈病基因分布，为四川麦区合理利用条锈病抗源提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

220 份四川小麦种质，包括150 份1997—2016年间四川育成品种、70份四川农家种70份（附表）；8 份已知条锈病抗性基因载体材料，包括AvSYr5NIL、AvSYr10NIL、AvSYr15NIL、AvSYr17NIL、AvSYr18NIL、AvSYr26NIL、CN19（Yr41）和PI 610750（Yr48）等作为抗条锈病基因分子检测的阳性对照，Avocet S 作为阴性对照；铭贤169 作为室内苗期鉴定条锈菌诱发和感病对照；SY95-71 和Avocet S 分别作为田间成株期条锈病鉴定诱发行和感病对照品种。上述种质均由四川农业大学小麦研究所收集保存。苗期采用条锈菌单小种CYR34 接种鉴定，成株期则为CYR32、 CYR33、 CYR34、 Sull-4、 Sull-5、 Sull-7和G22-14等量组成的混合菌。上述条锈菌均由甘肃农业科学院植物保护研究所贾秋珍研究员提供。

1.2 室内苗期和成株期条锈病表型抗性鉴定

苗期条锈病鉴定在四川农业大学小麦研究所病害鉴定温室进行。将供试小麦种质播种于育苗盒内，每个育苗盒播种5～10粒，在光照16 h/d，黑暗8 h/d 条件下培养至二叶一心，室内温度为15～18 ℃。将活化好的条锈菌孢子充分混匀于异构十二烷中，采用喷接法均匀喷洒在植株叶片表面，置于低温（8～10 ℃）高湿（湿度85%～95%）的接种培养箱中，黑暗条件下培养24 h 后转移至光照培养箱（15～18 ℃光照16 h/d，10～12 ℃黑暗8 h/d）中生长。待感病对照品种铭贤169充分发病时按照0～9级反应型（infection type，IT）划分标准[13]进行条锈病苗期表型鉴定。其中，0～3 级为高度抗病（high resistance,HR），4～6 级为中度抗病(moderate resistance,MR)，7 级为中度感病（moderat susceptible,MS），8～9级为高度感病（high susceptible,HS）。

于2016年10月中下旬分别在四川农业大学温江小麦条锈病鉴定圃（成都温江区，17WJ）、四川农业大学崇州小麦条锈病鉴定圃（成都崇州市，17CZ）及绵阳市农业科学院小麦条锈病鉴定圃（四川绵阳，17MY）进行成株期表型鉴定材料播种工作。每份种质3 行区，田间播种采取单粒点播，行长2 m，行距0.3 m，每行种植20粒种子，株距0.1 m，间隔20行区设置1行Avocet S感病对照；行区四周播种2行感病材料SY95-71作条锈菌诱发行。次年1月中旬采用涂抹法在诱发材料SY95-71倒数第二叶中部接种混合菌种，待3月下旬至4月中上旬感病对照Avocet S充分发病后，调查成株期条锈病反应型和严重度（disease severity,DS）。反应型调查标准参照R.F.Line等[13]，反应型抗感分级标准参照苗期划分。严重度是指病原菌孢子堆占整个叶片面积的百分数，调查方法参照小麦条锈病测报技术规范[14]，按照0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%分级记录。其中，高抗（0≤DS≤20%）、中抗（20%

1.3 已知条锈病抗性基因特异分子标记检测

采用改良的CTAB 法[15]提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量以及超微量分光光度计测定DNA 浓度和纯度，用超纯水将DNA 原液稀释至100 ng/µL。利用已知条锈病抗性基因Yr5[16]、Yr10[17-18]、Yr15[19-20]、Yr17[21]、Yr18[22-23]、Yr24/26[24-25]、Yr41[26]和Yr48[27]的功能标记或紧密连锁分子标记进行检测。DNA 分子标记引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。利用荧光定量PCR 仪（CFX96 Touch，美国Bio-Rad）进行Yr18的KASP标记基因分型，其余特异标记通过琼脂糖或6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完成。

2 结果与分析

2.1 苗期条锈病抗性表型鉴定

室内苗期鉴定结果显示，220 份四川小麦种质中，共56份种质表现出抗性（IT≤6），包括27份农家种和29 份育成品种。其中，29 份种质对CYR34 苗期表现为高抗（IT≤3），包括16 份农家种和13 份育成品种。

2.2 成株期条锈病抗性表型鉴定

利用混合菌种进行人工诱发，在多个环境点对220 份种质进行成株期条锈病抗性表型鉴定。在17CZ 鉴定圃，136 份种质（61.82%）表现出成株期抗性（IT≤6，DS≤60%），包括52 份农家种和84 份育成品种；在17MY鉴定圃，共154份种质（70.00%）表现出成株期抗性，包括60份农家种和94份育成品种；在17WJ鉴定圃，共108份种质（49.09%）表现出成株期抗性，包括48份农家种和60份育成品种。综合3个鉴定圃抗性鉴定结果，93份种质表现出稳定成株期抗性，包括40份农家种和53份育成品种。3个环境中表现稳定高抗（IT≤3，0≤DS≤20%）的种质共51份，包括19份农家种和32份育成品种。

2.3 抗条锈病表型综合评价

综合苗期和成株期条锈病表型鉴定结果，25份种质在苗期和成株期均表现出稳定抗性，包括13份农家种和12 份育成品种。其中有9 份种质表现出稳定高抗水平，包括6 份农家种（开江白麦子、安岳红小麦、灌县白花干麦儿子2、酉阳光头、江油露山麦和白玉小麦）和3份育成品种（西昌19、绵麦45和昌麦28），这些种质可进一步用于小麦生产，并作为小麦抗病育种的亲本资源。

2.4 抗条锈病基因检测结果

以Avocet S和相应基因载体分别作为阴性对照和阳性对照，分别使用8个Yr基因的连锁标记或功能标记对220 份四川小麦进行分子检测。结果显示，所有供试种质中均未检测到Yr5和Yr15，仅在少数种质中检测到Yr10和Yr48，Yr17、Yr18、Yr24/26和Yr41被检测到的频率较高（表1），其中Yr17和Yr24/26分别只在35和72份育成品种中检测到。共计66份种质中检测到Yr18，但大部分为农家种，仅包含3份育成品种（图1）。37 份种质检测到Yr41，包括7份农家种和30份育成品种。

图1 利用Yr18的连锁标记csLV34检测14份种质Figure 1 Detection of Yr18 in fourteen wheat germplasms by using the linked marker csLV34

表1 Yr基因在四川小麦中的分布Table 1 The distribution of each Yr gene in Sichuan wheat

此外，32份种质未检测到本研究中的任何Yr基因，包括8 份苗期抗性种质、14 份成株期抗性种质（包括9 份表现为稳定高抗：川农17、绵阳35、西昌19、昌麦26、川麦48、昌麦28、川辐8 号、川育26 和科成麦5 号）及苗期和成株期均表现抗病的4 份种质（川农17、西昌19、昌麦28 和昌麦33）在内的32份四川小麦均未检测到供试Yr基因，推测这些种质可能含有其他已知或未知的Yr基因。已知基因分子检测还发现，10 份农家种和31 份育成品种携带两个及以上Yr基因（附表）。

3 讨论

四川是我国条锈菌新小种的策源地之一，生产上大部分重要条锈菌生理小种的产生和流行均与该麦区有关[1,28-30]。因此，明确四川麦区育成品种的条锈病抗性及抗性基因的分布对于进一步开展小麦条锈病抗性育种具有重要意义。本研究利用当前小麦生产上条锈病流行强毒性优势小种CYR34及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7和G22-14 组成的混合生理小种对220 份四川小麦（包括150 份1997—2016年间育成品种、70 份农家种）分别进行室内苗期和田间成株期条锈病抗性表型鉴定。结果显示，56 份种质（25.45%）苗期对CYR34 表现出抗性，93 份成株期（42.27%）对包含CYR34在内的混合生理小种具有稳定抗性。其中，29份育成种质表现苗期抗性、53份表现出成株期抗性；而在供试农家种中，27份表现苗期抗性、40份表现出稳定成株期抗性。上述抗性种质为小麦条锈病抗性基因发掘及育种提供了可用的基因源。

基于Yr基因分子紧密连锁/功能标记对四川小麦进行分子检测发现，来自四川麦区的农家种与育成品种中Yr基因的分布差异显著。Yr18是一个成株期条锈病持久抗性基因，其育种应用在全球已有超过百年历史。研究结果发现，在四川小麦中绝大部分农家种质（90%）均携带了Yr18；但有意思的是，在1997—2016年间四川育成种质中，仅发现3个品种（绵阳33、西辐14和川育21）携带Yr18。上述研究结果与前人研究基本一致[31-34]，表明该基因鲜有在四川小麦条锈病抗性育种利用。Yr17来自偏凸山羊草，其最早可追溯到20世纪80年代通过引进墨西哥小麦品种而被广泛应用到四川小麦育种中[35]，该基因对当前我国流行的优势小种CYR34已丧失抗性。特异标记分子检测发现，所有供试农家种均未发现携带Yr17；约23.33%的四川育成品种（35份）检测到携带该基因。结合抗性表型分析发现，仅携带Yr17的育成品种中，4份表现苗期抗性，推测这些育成品种可能其他已知或未知的抗性基因。由普通小麦-簇毛麦育成的92R 易位系携带苗期抗性基因Yr24/26，该基因被广泛用于四川小麦育种。2009年强毒性条锈菌生理小种CYR34的出现导致以Yr24/26作为主要抗源的川育、川麦和贵农系普遍丧失抗性[4-5]。本研究从150 份育成种质中共检测到72 份品种携带Yr24/26，占比高达48%，表明在1997—2016年间四川条锈病抗性育种应用中，以携带Yr24/26的抗源占据主导地位。Yr41来自于四川小麦育成品种川农19，并认为该基因对当前我国小麦生产上流行的主要生理小种CYR31、CYR32 和CYR33 等均具有抗性[36]，但CYR34 对其具有毒性。以川农19为抗源，育成了包括川农26、川农27和渝麦13 等一系列抗条锈病新品种[37]。本研究基于Yr41特异分子跟踪标记检测发现，该抗源被四川麦区多家育种单位广泛应用。利用该抗源特异分子标记进行检测发现在1997—2016年间育成品种中，共发现30 个小麦品种携带Yr41；同时，也发现该基因存在部分四川农家种中。结合抗性表型分析发现，仅携带Yr41的8份四川小麦中，2份种质表现出苗期抗性、1份种质表现出成株期抗性，这些抗性种质很可能聚合了其他抗性位点。Yr48来自于墨西哥六倍体春小麦PI610750，目前在中国麦区仍然具有抗性[26,38]。在四川小麦中共发现20 份种质携带Yr48，包括8 份农家种和12 份育成品种；令人疑惑的是，结合表型发现其中13份种质表现不同程度的感病，其原因有待进一步研究。Yr10来自于小麦品种Moro，对当前流行生理小种CYR34 已失去抗性[13,39]。分子检测发现，该基因仅存在于2 份（川农11和川农18）育成品种中，表明在1997—2016年间已很少利用该基因作为抗源应用到四川小麦抗病育种中。Yr5和Yr15分别来源于小麦野生近缘种斯卑尔脱小麦（TriticumspeltaL.）和野生二粒小麦（TriticumdicoccoidesL.），对当前世界范围内绝大多数条锈菌生理小种均表现为高抗或近免疫[40-41]，也是少数对当前中国麦区流行的条锈菌生理小种具有抗性的Yr基因。习玲等[42]对2016年以来育成的78 个四川小麦品种（系）进行条锈病抗性基因检测发现，包括绵麦538、西科麦557、蜀麦1829、蜀麦1868 及川麦1747 等5 个小麦品种携带了Yr15。本研究利用Yr15功能标记对1997—2016年间四川育成种质进行检测，并未发现这一时期育成品种携带该基因。上述研究结果表明，在四川麦区对Yr15的育种利用起始于近年，可能与条锈菌新小种CYR34的出现与流行有关。和前人研究结果一致，本研究也未发现来自于斯卑尔脱小麦全生育期条锈病抗性基因Yr5在四川育种中的利用[43]。

培育持久抗病种质是除产量相关性状外育种家的首要目标。如何利用有限的抗源提高作物持久抗病能力是当前抗病育种的重点。但回顾这些研究表明，Yr基因的金字塔化部署（将多个基因聚合在同一品种）时可能更持久[44-45]。实际生产中，应用Yr基因丰富程度越高，条锈菌选择压力越小，变异产生新的毒性生理小种概率越小。但在抗病基因聚合时，需要提前了解聚合基因的田间实际表现，否则可能面对诸如基因之间上位效应、基因型与环境互作影响抗性表达和抗性基因相关的生理成本等问题[46]。