抗穗发芽合成小麦改良品系的筛选及遗传分析

藏天青，刘玉娥，马春芳，李 潇，王希友，郝 明，张连全，袁中伟，姜 博，刘登才，甯顺腙

（四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室/小麦研究所，成都 611130）

小麦在收获期遭遇连阴雨或潮湿天气时，尚未收获的小麦成熟籽粒会在穗上发芽，这种现象被称为穗发芽（pre-harvest sprouting，PHS）[1]。小麦穗发芽会导致小麦籽粒内部水解酶活性增加，内部储藏物质被分解消耗，从而造成籽粒容重和千粒重下降，导致小麦减产和品质劣化[2]。近年来，全球气候变暖和极端天气事件频繁发生，导致小麦成熟至收获期间穗发芽现象日益普遍，严重削减了小麦产量并降低了品质，穗发芽已成为全球性的威胁[3]。中国、美国、澳大利亚、日本和加拿大等国都曾遭受过穗发芽造成的巨大损失[4-8]。

小麦穗发芽是一个复杂的数量性状，由多个基因控制，其遗传基础复杂且易受环境影响，包括内因、外因和内外因互作三个方面的因素[9]。虽然，小麦的穗发芽受多重因素的影响，但是遗传因素是导致其抗性高低的主要原因[10]。

合成小麦是人工创制的六倍体小麦，可以用来转移四倍体或二倍体供体中优异基因的重要遗传资源，提高普通小麦的生产能力[11-12]。利用人工合成小麦成功选育出了具有重穗、抗旱、抗冻等不同特点的多个小麦品种[13]。同时，合成小麦在小麦抗穗发芽育种中具有非常重要的价值[14-15]。因此，多年多环境条件下，筛选抗穗发芽的材料，挖掘其穗发芽抗性基因对培育抗穗发芽新品种非常重要。

1 材料和方法

1.1 试验材料

129份合成小麦改良品系及其亲本（表1）。合成小麦改良品系根据它们的组合来源，分为3个群体。其中，白皮群体1含有31个品系，组合为Syn-SAU-86/Y11 (绵06-374)//B506 F10及以上世代；白皮群体2含有60个品系，组合为Syn-SAU-26/川07001//B506 F9及以上世代；红皮群体含有38个品系，组合为Syn-SAU-23/川07005//B2SHW-L1 F9及以上世代。以上材料均保存于四川农业大学小麦所。

表1 本研究所用试验材料的亲本Table 1 Materials of parents used in this study

1.2 试验方法

1.2.1 田间播种及管理

供试材料在温江试验基地（WJ）、崇州现代化农业生产基地（CZ）和四川省农业科学院新都现代农业科技创新示范园（XD），连续2年（2020—2021年和2021—2022年）种植。单行种植，行距1.8～2.0 m，行间距0.3 m，每行种植15～20株。田间管理遵循当地惯例。

1.2.2 Wheat 55K芯片及SNP标记分析

Wheat 55K基因分型由北京中玉金标记生物公司完成。原始的55K数据进行质控，首先计算样品的Dish QC (DQC)和Call Rate (CR)值，参考基因组为IWGSC_RefSeq_v1.0，质控筛选标准为DQC≥0.82、CR≥5。使用Affymetrix (Thermo Fisher) Axiom Analysis Suite 软件，通过apt-genotype-axiom、ps-metrics和ps-classification模块进行基因分型分析，将otv标记进行otv-caller分析，从而得到样品的原始数字基因型。然后，使用apt-format-result模块获得原始基因型数据。为了减少假阳性的发生，原始的基因型数据进一步进行数据质控，使用Plink 进行质控，参数为SNP缺失率>0.2，次等位基因频率(MAF)≤0.05。

1.2.3 穗发芽表型的鉴定和分析

小麦穗发芽的鉴定采用室内脱粒发芽法[16-17]。在小麦蜡熟末期，每个品系取5～10 个主茎穗，常温避光通风处理7 d。随后进行人工脱粒，剔除受损和发育不良的种子，将脱粒后的种子于-20 ℃冷冻保存。

每个品系选取50 颗种子，3 次重复，用15%次氯酸钠消毒种子10 min，再用无菌水清洗2 次。随后，将种子置于铺有滤纸的培养皿中，加入无菌水（3～5 mL）以湿润滤纸。发芽环境温度维持在20 ℃±1 ℃，控湿避光。加水当日记为第0 天，之后于第1、3、5和7天分别统计发芽数量。

发芽指数与发芽率计算方式：

（1）发芽率GR (germination rate)=7 d 发芽总数/用于鉴定的种子总数；

（2）发芽指数GI (germination index)=(7×n1+5×n3+3×n5+1×n7)/7×N

(n1、n3、n5、n7为第1、3、5、7 天的发芽数，N为用于发芽的种子总数)。

本研究以前人的研究[14-15,17]为基础结合根据实际情况，将平均发芽率≤20%且发芽指数低于≤0.1的样品定为高抗穗发芽，发芽率≤40%且发芽指数低于≤0.2 的样品定为抗穗发芽，发芽率≤60%且发芽指数低于≤0.3 的样品定为中抗穗发芽。发芽率和发芽指数统计使用Microsoft Excel 和Spss 16.0 软件进行分析。相关系数(r)的解释为：0≤|r|≤0.3 为弱相关，0.3<|r|≤0.5为低相关，0.5<|r|≤0.8为显著相关，0.8<|r|≤1 为强相关。绘图结果使用R 软件(R core team 2014)、ggplot2和OrignPro。

1.2.4 群体遗传结构分析

使用Structure v2.3.4软件进行群体结构分析，采用一般线性模型和基于Bayes数学模型进行群划分。设置参数：Burn-Period 长度为10 000，Burn-in 后的MCMC 重复次数为100 000。选择Admixture Ancestry 模型和Dependent Allele Frequencies 模式。K值（群体数量）选择，从K=1到K=10进行分析，每个K值重复运行5次。通过分析最优K值来确定最合适的分群方案，并估计群体结构，结果上传到Structure Harvester[18]在线网站使用TASSEL 5.0 软件分析，结果图表绘制使用R软件(R Core Team 2014)。

1.2.5 全基因组关联分析和连锁不平衡分析

基于高质量SNP标记，使用TASSEL 5.0软件建立广义线性模型(GLM)进行全基因组关联分析(GWAS)，判断SNP 标记与表型之间的关联显著性，并绘制Manhattan 图和QQ Plot 图。在GWAS 分析中，一般当P值≤0.001时，被认为该标记与性状具有显著关联。在关联结果中，标记的-log10(P)≥3 可以被视为显著关联的分子标记[19]。为了确定目标位点，需要选择那些在至少2 个环境或年份都能检测到，或者染色体上重复频次较高且R2和P值都较高的相邻位点作为显著关联的位点。

使用位点间的相关系数平方（R2）作为衡量多态性位点之间连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）的参数。首先，使用Plink 软件整理基因型格式，并利用PopLDdecay 工具进行LD 衰减的计算。对LD 衰减距离的估算有以下选择标准：LD 系数降低到最大值的一半、LD 系数降低到0.5 以下、LD 系数降低到0.1以下，或者LD系数降低到基线水平[20]，结果使用R软件可视化处理，绘制LD衰减图。

1.2.6 潜在候选基因分析

通过GWAS 分析，获得了一些可能的关联性QTL 位点，与目标性状存在关联性。利用中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0 以及基因组注释文件RefSeq Annotation v1.1[21]，使用在线网站Ensembl 和JBrowse，对相关基因位点进行功能注释和检索，以确定可能的目标候选基因。

2 结果与分析

2.1 穗发芽表型的鉴定

合成小麦Syn-SAU-23、Syn-SAU-26、Syn-SAU-86和SHW-L1 的发芽指数分别为0.26～0.33、0.11～0.18、0.61～0.78 和0.33～0.37（表2）。其中，Syn-SAU-26 的发芽指数最低，低于0.2。这4 个合成小麦的发芽率分别为40%～53%、24%～26%、75%～90%和40%～52%（表2），其中Syn-SAU-26 的发芽率也是最低。可以看出Syn-SAU-26在穗发芽方面具有优异的抗性，其2 个指标的平均评级为抗（GI≤0.2；GR≤40%），Syn-SAU-23 和SHW-L1 的评级为中抗（GI≤0.3；GR60%），而Syn-SAU-86的穗发芽抗性较差（图1）。

图1 合成小麦改良品系亲本发芽情况(发芽第3天)Figure 1 Germination status of parents and their improved strains (The 3rd day of germination)

表2 亲本材料发芽指数及发芽率Table 2 Germination index and germination rate of parents

品系Y11、B506、川07001 和川07005 的发芽指数分别为0.67～0.88、0.37～0.46、0.10～0.27 和0.35～0.46（表2）。四个品系的发芽率分别为93%～97%、46%～60%、30%～57%和82%～83%（表2）。其中，川07001 的2 个指标平均评级为中抗（GI≤0.3；GR≤60%），而其余品系的穗发芽抗性较差（图1）。

合成小麦Syn-SAU-86 的改良群体1 的平均发芽指数和平均发芽率显著高于其他2个群体，表明其对穗发芽抗性较弱（图2）。剩下的2个群体具有好的穗发芽抗性（图2），均表现为中等抗性水平（GI≤0.3；GR≤60%）。

图2 多环境下发芽指数与发芽率的箱线图Figure 2 Box line diagram of germination index and germination rate in multiple environments

成功筛选出了3 份抗穗发芽品系（图3），分别是品系L2741、L3006和L5861。它们的发芽指数分别在0.12～0.19、0.09～0.19 和0.1～0.21 之间，相应的发芽率范围为36%～43%、23%～45%和24%～52%（表3）。3 份品系在多个环境中指标平均值达到抗穗发芽的水平（GI≤0.2；GR≤40%）。品系L2741 和L3006 的抗性基因推测来源于亲本Syn-SAU-23 或B2SHW-L1，而L5861 的抗性基因推测来源于Syn-SAU-26或川07001。

图3 抗穗发芽品系及部分亲本发芽情况 (发芽第3天)Figure 3 Strains with PHS resistance and partial parents (The 3rd day of germination)

表3 不同环境下抗穗发芽品系的发芽指数(GI)和发芽率(GR)Table 3 GI and GR of improved strains with PHS resistance in multiple environments

2.2 SNP标记的多样性及群体结构分析

从49 063 个55K 分子标记中共筛选出26 955个高质量的标记。其中，A基因组上有7 974个SNP标记，B 基因组上有11 185 个标记，D 基因组上有7 015个标记。进一步分析，SNP标记在第3同源群上分布最多，共计4 423 个，而第2 同源群上的分布最少，共计3 113个。另外，4B染色体上的SNP标记最多，共计2 277 个，而6A 染色体上的SNP 标记最少为647个（表4）。

表4 SNP标记等位变异在基因组的分布情况Table 4 Distribution of SNP marker allelic variation in the genome

群体结构分析，当K=3时，ΔK出现峰值（图4），K=3 是最优的群体数目。改良品系分为3 个亚群（图4），符合预期结果。

图4 抗穗发芽品系群体结构分析Figure 4 Population structure analysis of strains with PHS resistance

2.3 群体的全基因组关联分析

在6个环境中，有2个环境检测到显著性位点，分别是2021年新都位于2B、5D、7D染色体上，2022年崇州位于2B、4A、5D、6B染色体上（图5）。结合2个环境的数据，分析了2B及5D上的显著性位，发现有2 个显著标记在2 个环境均能检测到，分别是位于5D染色体的AX-111317347标记和AX-109336147标记，可以解释19.69%和20.05%的表型。而位于2B染色体AX-111492645 标记（2022年崇州），该点的P值最高且R2值也比较高，故也视为显著性位点。

图5 不同环境的曼哈顿图及QQ-Plot图Figure 5 Manhattan diagram and QQ-Plot diagram in multiple environments

根据全基因组连锁不平衡（LD）系数衰减至基线水平作为判定标准，可以确定连锁不平衡（LD）衰减距离为0.78 Mb（红色虚线交会处）（图6）。基于该衰减距离，将在物理图谱前后0.78 Mb 区间内的位点视为候选位点。

图6 连锁不平衡(LD)衰减图Figure 6 Linkage disequilibrium (LD) decay diagram

2.4 合成小麦改良品系穗发芽候选基因功能预测

根据LD衰减距离0.78 Mb，挖掘了3个标记上下游各0.78 Mb内的基因，总共有46个基因（附表），通过对连锁范围内的基因进行基因注释，其中有4个基因初步推测与穗发芽有关作为可能的候选基因（表5）。

表5 根据注释确定的候选基因Table 5 Candidate genes identified based on annotations

3 讨论与结论

3.1 抗穗发芽合成小麦改良品系筛选

普通小麦的六倍化起源过程中，仅有少数的原始六倍体个体参与驯化，因此供体物种四倍体小麦和节节麦的大量遗传变异被排斥在外[26-27]，进而导致原始普通小麦的遗传多样性低。作为重要遗传资源的合成小麦可以转移四倍体或二倍体供体中优异基因，提高普通小麦的生产能力[11-12]。目前，通过改良人工合成小麦的方式已经成功选育出多个优良的小麦品种[13]。同时，合成小麦在小麦抗穗发芽育种中具有非常重要的价值[14-15]。

本研究使用了129 份合成小麦改良品系，在连续6 个环境(2年3 点)下测定了脱粒种子的发芽率，从而对穗发芽抗性进行了评价和鉴定。共获得了3份穗发芽抗性稳定的品系，分别为红皮品系L2741 和L3006，以及白皮品系L5861（图3）。这些品系的发芽指数分别为0.12～0.19、0.09～0.19和0.1～0.21，发芽率分别为36%～43%、23%～45%和24%～52%（表3），均达到了抗穗发芽的水平(GI≤0.2；GR≤40%)。这3份抗穗发芽品系可在培育抗穗发芽新品种选育中利用。

3.2 穗发芽相关候选基因的功能预测

本研究利用多年多点的全基因组关联分析，共检测到了99个显著关联的SNP位点，初步将这些关联位点定位在2B和5D染色体上。为了确定与穗发芽抗性相关的基因，基于普通小麦基因数据库IWGSC RefSeq v1.0，采用连锁不平衡的衰减距离0.78 Mb 的标准，在目标位点上下游各0.78 Mb 范围内进行基因的筛选和注释。从46个基因中，初步确定了4 个潜在的候选基因。TraesCS2B03G086530 0.1是一个编码F-box家族蛋白的基因。F-box蛋白参与植物的多个生命过程，例如光合作用中光信号的传导、植物激素的信号转导以及花器官的发育[28]。贾琪等[22]在对F-box蛋白家族在抗逆作用中的研究中发现，F-box 蛋白通过介导抗逆相关蛋白的泛素化调控植物对逆境的应答。在逆境条件下，负调控蛋白被泛素化降解，导致正调控蛋白表达增加，从而启动抗逆反应，其通常会影响脱落酸（ABA）和乙烯等植物激素的信号转导。脱落酸不仅抑制小麦种子的发芽，还通过抑制α-淀粉酶的活性来抑制小麦发芽，从而实现抗穗发芽的效果[29]。TraesCS5D03 G1120100.1为植物的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)。LOX 是植物十八碳酸代谢的关键酶，与种子老化、抗逆境胁迫等生理生化有关[23]。研究表明，水稻中LOX活性的下调可以提高种子的发芽效率[30]。LOX可以催化种子萌发过程中贮藏物质的降解，并合成传递生物和非生物胁迫的信号分子。TraesCS5D03 G1120600.1属于Squamosapromoter-binding-likeprotein(SPL)基因家族，在植物的形态建成中起着重要作用[31]。高新梅等[24]发现该基因在小麦中可能参与光形态建成、叶片生长、胚乳和分生组织的表达、赤霉素、脱落酸等激素信号转导途径中，作为干旱和逆境应激信号的顺式作用元件起作用。赤霉素和脱落酸在调控籽粒萌发过程中相互拮抗，种子打破休眠时，通常伴随着脱落酸的下降和赤霉的上升[32-33]。TraesCS5D03G1160900.1是与抗逆性相关的DUF4220基因。通过将DUF4220基因在拟南芥中参与了脱落酸信号途径，在高温（45 ℃）处理下，转基因种子的发芽率明显低于对照，表明过量表达该基因可能会降低植株的抗逆性[25]。这4个潜在的候选基因是与小麦穗发芽抗性相关的重要位点，有待进一步验证。