漆酶BmLac 的异源表达、酶学特性及棉酚降解的研究

魏婷柳 苗华彪，2 吴倩，2 黄遵锡，2

（1. 云南师范大学生命科学学院，昆明 650500；2. 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

随着畜牧业的快速发展，我国饲料原料极其紧缺。我国是棉花生产大国，每年都会有棉花副产品产生，如棉籽粕、棉籽壳［1］。棉籽粕粗蛋白含量34%-40%，优质蛋白含量约22.5%［2］，可作为植物性蛋白原料［3］，部分缓解饲料原料紧缺的现状，但棉籽粕中含有游离棉酚（free gossypol）抗营养因子，限制了其在饲料工业上的应用［4］。游离棉酚会引起人体、动物组织和器官高度中毒［5］，导致生殖功能障碍［6］，肝功能受损，呼吸窘迫［7-10］。目前降解棉籽粕中游离棉酚的方法有物理法、化学法、微生物发酵法、酶解法［11］，前两种方法会影响棉籽粕的风味，脱毒效率低［12］，微生物发酵法是目前最佳脱除棉籽粕中游离棉酚的方法［4］，但是此法操作复杂，对所用菌株类型及其用量要求严格。酶解法相比于其他方法是安全、绿色的方法。

漆酶（laccas，EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶（MCOs）家族，MCOs 是一类在自然界中广泛分布，氧化多种底物时以氧为电子受体将O2还原为H2O 的一类含铜的蛋白质［13］。漆酶由3 个铜氧还蛋白结构域（D1-D3）组成，其活性中心是4 个铜离子，I 型铜有共价铜-半胱氨酸键，是底物氧化的部位；II型铜有2 个组氨酸残基配体，在电子顺磁共振（EPR）下有一个特征信号；Ш 型铜是一个具有抗偶磁性并有6 个组氨酸残基配体的双核铜中心，与II 型铜形成三核中心成为氧的还原部位［14-17］。

漆酶在高等植物、昆虫、细菌和真菌中均能产生［18］。目前细菌和真菌来源的漆酶研究较多，真菌漆酶虽然是被用于工业生产最多的漆酶，但其产酶量低、发酵周期长、高温下稳定性差［19-21］。细菌漆酶能在较宽的温度和pH 下作用，高温下稳定性良好，对抑制剂有一定的稳定性［22-23］。在Azospirillum lipoferum中较早发现原核漆酶［24］，随后从Pseud‑omonassp.［25］、Escherichia coli［26］和B.subtilis［27］中相继发现漆酶。枯草芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白CotA是细菌漆酶的典型代表，目前已报道产生漆酶的芽孢杆菌有B.clausii［28］、B.amyloliquefaciens［29］、B.licheniformis［30］、B.pumilus［31］和B. thuringiensis［32］。Wang 等［33］首次发现漆酶能催化棉酚的分子内环化反应，将棉酚的醛基和羟基氧化为半醌自由基，并产生释放的羟基自由基。本文通过菌株筛选，获得一株B.amyloliquefaciensXP‑13并从中挖掘漆酶基因，并在毕赤酵母中异源表达获得BmLac 蛋白，测定其酶学性质及对棉酚的降解效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒 解淀粉芽孢杆菌、大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、pPic9k 由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 ABTS（罗恩公司），棉酚（上海源叶），细菌基因组提取试剂盒及质粒提取试剂盒购自Omega 公司，pMD‑18‑T、rTap 酶、EcoR I、NotI、SalI 均购自TaKaRa 公司，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基 筛选培养基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%琼脂、0.25 mmol/L CuSO4。

Amp‑LB：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%琼脂、终浓度100 μg/mL 的Amp。

YEPD：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂。

发酵培养基BMGY、BMMY 根据毕赤酵母操作手册配制（由Invitrogen 公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选 土样采集于普洱市思茅区茶山，称取1 g 土样于含0.25 mmol/L CuSO4的LB 培养基中37℃，180 r/min 培养12-24 h，稀释倍数涂布于含0.25mmol/L CuSO4的LB 固体培养基，37℃培养箱中培养4-5 d，在菌落周围滴加1 mmol/L ABTS，菌落周围出现绿色，表示有漆酶活性。将显色菌落进行多次平板划线纯化，进行鉴定。

1.2.2 菌株鉴定 XP‑13 菌株基因组用细菌基因组试剂盒提取，以基因组为模板，27F、1492R 为引物，PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃90 s；72℃ 10 min，30 个循环进行16S rDNA 扩增，胶回收纯化，与pMD‑18‑T 载体连接后转化到DH5α感受态细胞，进行菌落PCR 阳性克隆验证。测序结果16S rDNA 序列在NCBI 进行BLAST 同源比对，用MEGA‑X 软件构建系统发育树。使用光学显微镜观察XP‑13 的芽孢。

1.2.3 漆酶BmLac 的分析、克隆与表达

1.2.3.1 漆酶BmLac 的分析 将BmLac基因序列在NCBI 进行BLASTX 分析，用ExPASY 进行BmLac 的PI/MW 以及带正负电荷总数预测，用Pfam 进行蛋白质结构域预测，PSIPRED 二级结构预测，SWISS‑MODEL 进行三级结构预测。

1.2.3.2 漆酶BmLac 的克隆与表达 根据pPic9k 序列设计BmLac 上下游引物，引物序列如下：

F：5'‑GCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGGCAC TAGAAAAATTTGCAG‑3'；

R：5'‑AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCCTGCT TATCCGTGACGTCCA‑3'。

以XP‑13 菌株基因组为模板，以F、R 为上下游引物，以PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；60℃1 min；72℃ 90 s；72℃ 10 min，30 个循环进行目的基因扩增，将pPic9k 用EcoR I、NotI 双酶切，胶回收纯化，回收产物用Exnase II 重组酶连接，获得重组质粒pPic9k‑BmLac。用SalI 酶线性化pPic9k‑BmLac 质粒，电转到毕赤酵母GS115 中，稀释涂布在含G418 抗生素的YEPD 平板筛选阳性转化子。

挑取阳性克隆于BMGY 培养基，30℃培养48 h，离心10 min，加入BMMY 培养基，30℃培养48 h，离心10 min，取上清液以ABTS 为底物测酶活，进行SDS‑PAGE：煮沸失活的酶液进行SDS‑PAGE后用考马斯亮蓝染色；具有活性的酶液进行SDS‑PAGE 后用0.5 mmol/L ABTS 进行染色，目的条带显示绿色。

1.2.4 漆酶酶活测定 酶活测定［34］：50 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.83 mL，50 mmol/L ABTS 120 μL，酶液50 μL，反应10 min，冰浴1 min 终止反应，分光光度计420 nm 读值，对照组调零。

酶活定义（U）：在特定条件下，在1 min 内转化1 μmol 底物所需的酶量。酶活计算公式：U/mL=（A×V0×106）/（V1×ε×d×T），其中A 是吸光度值，V0是反应总体系（mL），V1酶液体积（mL），ε 消光系数（εABTS=36 000 L/(cm·mol·L)，d 比色皿直径（cm），T 反应时间（min）。

1.2.5 漆酶酶学性质的测定

1.2.5.1 漆酶最适pH 及pH 稳定性测定 最适pH测定：将酶液于37℃、pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 的柠檬酸-磷酸氢二钠50 mmol/L 缓冲液反应10 min，分光光度计测吸光度，以最高酶活为100%。

pH 稳定性测定：将酶液与pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混匀在37℃下孵育1 h，在pH 4，55℃反应10 min，分光光度计测吸光度，以未处理酶液酶活为100%。

1.2.5.2 最适温度及温度稳定性测定 最适温度测定：酶液在最适pH、温度10、20、30、40、50、55、60、65、70、80、90℃下反应10 min，分光光度计测吸光度，以最高酶活为100%。

温度稳定性测定：酶液在70℃、80℃、90℃下分别耐受0、10、20、30、40、50、60 min，在pH 4，55℃反应10 min，分光光度计测吸光度，以0 min酶液酶活为100%。

1.2.5.3 金属离子及有机试剂对酶活性的影响 酶液反应体系中分别加入终浓度1 mmol/L、10 mmol/L的NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、ZnSO4、CoCl2、CuSO4、MgSO4、MnSO4、Pb(CH3CO2)2、FeSO4、NiSO4、FeCl3、AlCl3金属离子和有机试剂溶液Guanidine Hydrochloride、Urea、EDTA，在pH 4，55℃反应10 min，分光光度计测吸光度，以不加金属离子或有机试剂酶液酶活为100%。

1.2.5.4 漆酶动力学参数测定 配制不同浓度的ABTS，浓度分别是1、3、5、7、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50 mmol/L，在pH 4，55℃反应10 min，分光光度计测吸光度，计算酶活。

1.2.6 漆酶对棉酚的降解效果 总反应体系1 mL 中含：50 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、终浓度0.05 mg/mL 的棉酚、酶液（或终浓度1.25 mmol/L ABTS）。在反应体系中不加介体ABTS，在55℃下分别反应0 h、1 h、2 h；在反应体系中加入终浓度1.25mmol/L 的介体ABTS，在55℃下分别反应0 h、1 h、2 h；均以0 h 为对照。反应结束后过滤膜，通过高效液相色谱（HPLC）进行定性定量分析。HPLC 条件［35］：色谱柱型号：LCMS‑2020（C18，4.6 nm×250 nm，5 μm），流动相是乙腈∶0.2%磷酸=85∶15，流速1 mL/min，进样量20 μL，紫外检测波长235 nm，柱温25℃。

2 结果

2.1 XP‑13菌株鉴定

PCR 产物片段大小是1 500 bp 左右（图1‑A），在100 倍物镜下观察到大小均匀，呈圆柱形的芽孢（图1‑B），XP‑13 菌株的16S rDNA 测序结果通过NCBI 比对并构建了系统发育树（图1‑C），XP‑13 菌株与B.amyloliquefaciens是在同一分支，并且与B.amyloliquefaciens stiandB15 的同源性是99.93%，由此初步将该菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

图1 XP-13 菌株鉴定Fig. 1 Identification of XP-13 strain

2.2 漆酶BmLac的分析、克隆与表达

2.2.1 漆酶BmLac 的分析 通过NCBI blastx 比对显示，BmLac 与来源于解淀粉芽杆菌的多铜氧化酶家族的 WP_031378818.1 具有100%同源性；与Lysinibacillus fusiformis的漆酶AYW03784.1 的同源性是77.25%，与报道过具有降解棉酚效果的漆酶WP_161541154.1 同源性是19%。经ExPASY 预测了BmLac 的PI/MW 是6.34/58.07 kD，带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数是63 个，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数是56 个。通过Pfam 结构域分析BmLac 具有1 个Cu oxidase、1 个Cu‑oxidase_2 和2个Cu‑oxidase_3 结构域（图2‑A），PSIPRED 预测二级结构有α-helix（4.10%）、β-sheet（31.45%）、Coli（64.45%），说明该酶具有以β-sheet 为主，α-helix 为辅的二级结构。通过SWISS‑MODEL 预测BmLac 的三维结构（图2‑B）。

图2 漆酶BmLac 的分析Fig. 2 Analysis of laccase BmLac

2.2.2 漆酶BmLac的克隆与表达BmLac基因全长是1 536 bp，编码512 个氨基酸，PCR 产物验证条带大小正确（图3‑A），与pMD‑18‑T 载体连接测序结果正确。pPic9k 双酶切结果如图3‑B 所示。把重组质粒pPic9k‑BmLac 转入到毕赤酵母GS115，进行发酵诱导，取上清发酵液进行SDS‑PAGE 电泳验证。结果表明蛋白条带大小在58 kD 左右，与理论分子量一致（图4，泳道1），经ABTS 染色显示只有一条单一的目的条带，大小与理论分子量一致（图4，2 泳道）。

图3 BmLac 和pPic9k 凝胶电泳图Fig. 3 BmLac and pPic9k gel electrophoresis

图4 BmLac 的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of BmLac

2.3 漆酶BmLac酶学特性分析

2.3.1 最适pH 及pH 稳定性 对漆酶BmLac 进行最适pH 测定，结果表明在pH 4 时漆酶BmLac 的酶活达到最高（图5‑A）；酶液分别在37℃，pH 2.5-7保持60 min 后测定酶活，结果表明pH 2.5-3 相对酶活在50%以上，pH 3.5-7 之间相对酶活在90%以上（图5‑B），说明该酶作用的pH 范围较广。

图5 BmLac 最适pH 及pH 稳定性Fig. 5 Optimal pH and pH stability of the BmLac

2.3.2 最适温度及温度稳定性 在最适pH 4 测定不同温度下漆酶BmLac 的酶活，结果表明在40-65℃之间的相对酶活在70%以上，在55℃时酶活达到最高（图6‑A）。在pH 4，55℃条件测定的酶活是101.56 U/mL。漆酶BmLac 分别在70、80、90℃下保持60 min 后，在55℃，pH 4 下测定酶活，结果表明其相对酶活均在70%以上，未到达半衰期（图6‑B），说明该酶具有良好的热稳定性。

图6 BmLac 最适温度及温度稳定性Fig. 6 Optimal temperature and temperature stability of the BmLac

2.3.3 金属离子及有机试剂的影响 漆酶BmLac 在金属离子及有机试剂的存在下测定酶活，结果表明加入终浓度1 mmol/L Cu2+后酶活提高了1.93 倍，1mmol/L 的Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+等对酶活的影响不明显，而Fe2+几乎完全抑制；10 mmol/L 的Cu2+、Mn2+、Mg2+对酶活影响不明显，Pb2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+、Li+起到部分抑制作用，Fe3+、Al3+、Fe2+完全抑制酶活。1 mmol/L的Guanidine Hydrochloride、Urea 的相对酶活均保持在92%以上，10 mmol/L 的Guanidine Hydrochloride、EDTA 对酶活有部分抑制作用；10 mmol/L 的Urea 对酶活没有影响（表1）。

表1 金属离子和化学试剂对BmLac 的影响Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on BmLac

2.3.4 动力学曲线 以不同浓度1-5 mmol/L 的ABTS 为底物，在pH 4、55℃下测定酶活，利用GraphPad Prism 5.0 软件对结果进行非线性曲线拟合，如图7 所示，曲线计算得Vmax=（126.7±1.829）μmol/(min·mL)、Km=（0.451 9±0.034 9）mmol/L。

图7 BmLac 的动力学曲线Fig. 7 Enzyme kinetic curves of BmLac

2.4 漆酶BmLac对棉酚的降解

结果表明，不加介体反应1 h 后的棉酚降解率为84.07%，反应2 h 后的棉酚降解率为94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反应1 h 后棉酚降解率为95.68%，反应2 h 后棉酚降解率达到98.73%（图8）。该酶在无ABTS 存在时对棉酚降解的比较慢，而加入1.25mmol/L ABTS，反应1 h 后降解率比不加时提高了11.61%。

图8 BmLac 降解棉酚的HPLC 分析Fig. 8 HPLC analysis of BmLac degrading gossypol

3 讨论

棉籽粕不经处理饲喂动物，长时间积累会导致中毒，通过食物链传递直接或间接危害人类健康［36］。降低棉籽粕中游离棉酚的含量是提高棉籽粕利用率的重要途径。Wang 等［33］以小鼠体重的100 mg/kg棉酚和漆酶催化棉酚后的环化产物饲喂小鼠，结果表明经过漆酶催化的棉酚能降低棉酚对肝脏、生殖器官的毒性。王雨辰等［37］验证了棉酚在漆酶BA4、终浓度1 mmol/L ABTS 存在下，30℃和40℃分别反应1 h 后，棉酚的降解率均是30%。本文通过用漆酶BmLac 降解棉酚，不加介体反应1 h 后降解率是84.07%，反应2 h 后降解率是94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反应1 h 后降解率是95.68%，反应2 h后降解率达到98.73%，但没有证明BmLac 蛋白对棉酚是否发生分子内环化作用及催化产物种类分析。

近年对漆酶的研究越来越多，获得了来源广泛的漆酶基因，但是基于漆酶自身的局限性，还未获得满足工业生产需求的漆酶。解淀粉芽孢杆菌漆酶是芽孢外壁CotA 蛋白，有良好的热稳定性［38］，适合应用于工业生产，如B. amyloliquefaciensTCCC 111018 漆酶在80℃中孵育120 min 后留有酶活［30］；B. amyloliquefaciensA1 在80℃孵育10 min，相对酶活剩余79%［39］。真菌漆酶的热稳定性相比于其是较差的，如Ganoderma lucidumTR6 中通过RT‑PCR获得漆酶基因的cDNA，在最适温度60℃下孵育1 h，酶活几乎完全丧失［40］；Botrytis cinerea241 的Bcl1 漆酶在60℃孵育1 h 达到了半衰期，相对酶活剩余50%［41］。此外，其他细菌漆酶的热稳定性也比真菌漆酶好，如Li 等［42］从短小芽孢杆菌中获得漆酶rLAC，在最适温度80℃孵育1 h 后相对酶活剩余40%左右。Zhang 等［43］从宏基因组中得到漆酶Lacz1 蛋白，最适pH 4.5，最适温度75℃，在85℃下孵育60 min，相对酶活剩余20%。漆酶BmLac 最适pH 4，最适温度55℃，80℃下孵育1 h 后相对酶活剩余80%，在90℃下孵育1 h，相对酶活剩余70%，均未到达半衰期。该酶的最适温度比其他漆酶低，但其耐热性较好，具备用于工业生产的潜能。

金属离子、有机试剂对漆酶的影响也非常重要，BmLac 添加1 mmol/L CuSO4相对酶活提高了93%，添加1 mmol/L FeSO4却几乎完全抑制酶活。研究表明Cu2+对漆酶有激活作用，Zhang 等［43］在乙酸钠缓冲液中添加10 mmol/L 的CuSO4，酶活从0.10 U/mg提高至16.39 U/mg；Lin 等［44］在10 mg/L Cu2+下酶活提高15%，这可能是由于II 型铜的铜离子结合位点被Cu2+占据［45］。其他金属离子低浓度下对BmLac的影响不是很大，除了Fe2+几乎完全抑制酶活。

本研究从B.amyloliquefaciensXP‑13 获取漆酶基因，进行酶学性质测定及其对棉酚的降解效果。为后期降解棉籽粕中游离棉酚奠定基础，让棉籽粕成为植物性蛋白饲料原料成为可能，同时也能缓解饲料原料紧缺的现状。后续研究可通过对BmLac 漆酶进行分子改造，如蛋白质工程、酶分子修饰等，进而提高酶活、稳定性及游离棉酚降解效率，旨在获得一种适合于工业生产的漆酶。

4 结论

本研究从土壤中筛选得到一株产漆酶菌株B.amyloliquefaciensXP‑13，从中获得漆酶基因BmLac在毕赤酵母GS115 中异源表达获得漆酶BmLac 蛋白，最高酶活为101.56 U/mL，最适反应条件为55℃，pH 4，具有较好的热稳定性，对棉酚降解效果好，不加介体反应1 h 后棉酚降解率为84.07%，反应2 h后棉酚降解率为94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反应1 h 后棉酚降解率为95.68%，反应2 h 后棉酚降解率达到98.73%，具有成为漆酶酶制剂规模化生产及用于棉籽粕中游离棉酚降解的潜力。