珊瑚状猴头菇多糖的提取及其体外抗氧化活性分析

涂晓媛 褚路路 王冕 陈炳智，2 江玉姬，2

（1. 福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2. 福建农林大学菌物研究中心，福州 350002）

珊瑚状猴头菇（Hericium coralloides），属于担子菌亚门（Basidiomycetes），伞菌纲（Agaricomycetes），红菇目（Russulales），猴头菌科（Hericiaceae），猴头菌属（Hericium），又名松花蘑（长白山区）、玉髯［1］。子实体的形态特征为花椰菜状，新鲜时白色或淡黄色，干时淡褐色至锈褐色［2］。目前珊瑚状猴头菇已驯化成功，能够实现人工栽培，该食用菌含有多糖、猴头菌素、猴头菌酮、甾醇等功能成分［3］，具有利五脏、滋补、助消化，主要用于神经衰弱、胃溃疡等疾病，是一种优良的药用真菌［4］。

多糖是猴头菇主要活性成分之一［5］，对珊瑚状猴头菇多糖（H. coralloidespolysaccharide, HCP）的功能研究主要有增强机体的免疫力［6］、降血胆固醇［7］、抗氧化［8］、抗幽门螺杆菌［9］以及保护胃黏膜［10］等方面。近年来对食用菌多糖的研究较多，主要集中在香菇［11］、灵芝［12］、银耳［13］等，珊瑚状猴头菇是近几年栽培驯化成功的新品种，对珊瑚状猴头菇多糖的提取工艺优化研究较少，本试验采用热水浸提法探求珊瑚状猴头菇多糖最佳的提取工艺参数，并通过紫外吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、X‑射线衍射对珊瑚状猴头菇粗多糖的结构进行初步鉴定，同时研究珊瑚状猴头菇多糖的抗氧化活性。为后期进一步探索珊瑚状猴头菇多糖的功能活性提供基础，也为珊瑚状猴头菇的开发及深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

珊瑚状猴头菇由国家食用菌品种改良中心福建分中心提供；葡萄糖、水杨酸（均为分析纯）、双缩脲法蛋白含量检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；苯酚分析纯购于西陇科学股份有限公司；1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼（DPPH）、2,2‑联氮-二（3‑乙基-苯并噻唑‑6‑磺酸）二铵盐ABTS、抗坏血酸（VC）、硫酸亚铁、过硫酸钾、无水四硼酸钠、间羟基联苯（均为分析纯购于上海麦克林有限公司；95%乙醇购于福州鑫伟诚实验仪器有限公司；过氧化氢购于上海沃凯生物有限公司；正丁醇购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚状猴头菇粗多糖（HCP）的提取 新鲜的珊瑚状猴头菇烘干后研磨成粉，提取过程参考杨嘉丹等［14］的方法，并稍加修改：

将粉末与蒸馏水按1∶30（g/mL）混合，热水浴浸提后，浸提液5 000 r/min 离心10 min，取上清液用旋转蒸仪浓缩，在浓缩液中加入4 倍的95%乙醇，4℃下沉淀多糖；再将获取的粗多糖溶液使用Sevage 法（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）去除蛋白质后放入透析袋（截留分子12 000-14 000 Da）中透析24 h；最后把透析袋中多糖溶液5 000 r/min 离心10 min，取上清液并冷冻干燥得HCP。

1.2.2 珊瑚状猴头菇多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法［15］测定多糖含量，以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线。配制质量浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，分别取2 mL 于各试管中，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 浓硫酸溶液，避光放置15 min；以蒸馏水取代葡萄糖溶液作为空白对照，在490 nm 处测定其吸光度。绘制标准曲线得回归方程y=‑0.010 1+10.212 9x，R2=0.999 4。按照上述方法测定HCP 含量并根据标准曲线按公式（1）计算HCP 提取率：

公式中：P：多糖提取率（%）；C：多糖质量浓度（mg/mL）；N：稀释倍数；m：样品质量（g）。

1.2.3 单因素试验 按照1.2.1 方法提取珊瑚状猴头菇多糖，提取条件为：固定料液比1∶30（g/mL）、提取时间2.0 h、颗粒大小40 目，考察提取温度60、70、80、90、100℃对HCP 的影响；固定提取时间2.0 h、提取温度90℃、颗粒大小40 目，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）对HCP 的影响；固定料液比1∶30（g/mL）、提取温度90℃、颗粒大小40 目，考察提取时间1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h 对HCP 的影响；固定料液比1∶30（g/mL）、提取温度90℃、提取时间2.0 h，考察颗粒大小20、40、60、80、100 目对HCP 的影响。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验结果的基础上对最优的提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、颗粒大小（D）4 个因素，利用Design‑Expert 8.0.6进行四因素三水平的响应面分析试验，优化HCP 的热水浸提工艺参数，试验设计的方案见表1。对各因素水平下HCP 的提取率进行测定，并以计算所得的HCP 的提取率为响应值进行方差分析。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 化学成分测定 采用苯酚硫酸法测定总糖含量；双缩脲法测定蛋白质含量；以半乳糖醛酸为标准品，采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量［16］。

1.2.6 紫外光谱分析（UV‑Vis） 参考冯鑫等［17］的方法修改，将HCP 配制成质量浓度为0.1 mg/mL 的溶液，以水作为空白对照，在190-400 nm 波长范围内进行扫描。

1.2.7 傅里叶变换红外光谱分析（FI‑IR） 使用FI‑IR 测定多糖的官能团，将HCP 粉末与KBr 粉末混合并压缩成1 mm 颗粒，采集4 000-500 cm-1范围内的多糖光谱［18］。

1.2.8 X‑射线衍射（XRD）分析 参照文献［19］方法修改，采用X 射线衍射仪，扫描范围10°-90°，扫描速率步长为10°/min,采样间隔0.02°对HCP 进行扫描。

1.2.9 体外抗氧化试验 根据Chen 等［20］的方法稍加修改，测定HCP 清除DPPH 自由基能力。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 不同浓度的HCP 溶液。取1 mL 样品溶液加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液充分混合，常温避光反应30 min，在517 nm 处测定吸光度。空白组以95%乙醇溶液取代HCP 溶液；VC为阳性对照，操作方法与样品组相同，每组重复3 次，取其平均值，按公式计算DPPH 自由基清除率。

式中：A1：样品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：95%乙醇溶液取代DPPH 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所测的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

参考文献［20］的方法稍加修改测定HCP 对ABTS+自由基的清除能力，取7 mmol/L ABTS 溶液5 mL 和15 mmol/L 过硫酸钾1 mL 于23℃恒温箱中孵化12-16 h，使用时用蒸馏水稀释其溶液，在734 nm 处的吸光度为0.7±0.02。取0.75 mL HCP 溶液于试管中，再加入3 mL ABTS 溶液室温反应15 min，在734 nm 处测量不同浓度样品的吸光度。空白组以蒸馏水取代HCP 溶液；VC为阳性对照，操作方法与样品组相同，每组重复3 次，取其平均值，按公式计算ABTS+自由基清除率。

式中：A1：样品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸馏水取代ABTS 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所测的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

参考文献［21］的方法稍加修改，取1 mL HCP 溶液，分别加入5 mmol/L 的FeSO4、水杨酸、H2O2溶液各1 mL 混合，放入37℃恒温箱中避光反应30 min，测定其在510 nm 处测得吸光度。空白组以蒸馏水取代HCP 溶液；VC为阳性对照，操作方法与样品组相同，每组重复3 次，取其平均值，按公式计算羟自由基清除率。

式中：A1：样品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸馏水取代H2O2溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所测的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

1.2.10 数据统计与分析 采用SPSS Statistics 23.0进行数据处理，Origin 2021 软件绘图。

2 结果

2.1 珊瑚状猴头菇多糖提取的单因素试验

如图1‑A 所示，随着提取温度的升高HCP 提取率呈上升的趋势，当提取温度在80-90℃时，多糖提取率增长较快，当高于90℃，上升趋于平缓。综合考虑节约能源问题，提取温度选择90℃较为适宜。多糖提取率随着料液比的增大呈现先升高后降低的趋势（图1‑B），考虑加大溶液体积会使后期浓缩和沉淀工艺难度加大［22］，因此选择1∶30（g/mL）的液料比。如图1‑C 所示，当提取时间达到2.0 h 时，多糖提取率达到最高，提取时间超过2.0 h，多糖提取率下降，因此，选择提取时间2.0 h 较为适宜。随着颗粒大小的增加，多糖的提取率逐渐升高，当颗粒大小大于80 目后，多糖提取率开始下降（图1‑D）。因此，试验选择颗粒大小为80 目较适宜。

图1 不同提取条件对多糖提取率的影响Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction rates of polysaccharides

2.2 响应面法优化提取工艺

2.2.1 响应面试验结果及方差分析 根据单因素试验结果，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、颗粒大小（D）4 个因素为自变量，以珊瑚状猴头菇多糖提取率为响应值，利用Box‑Behnken 试验方案，进行四因素三水平的响应面分析试验。试验设计及结果见表2。回归分析见表3。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回归模型的方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

利用Design Expert 8.0.6 软件对数据进行二次回归拟合，得到珊瑚状猴头菇多糖的提取率对提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、颗粒大小（D）之间的二次多项回归方程为：Y=10.83+0.46A+0.30B+1.27C+0.1D-0.21AB-0.26AC+0.14AD-0.38BC-0.075BD-0.37CD-0.52 A2-0.43B2-1.63C2-0.7D2。

由表3 可知，P模型<0.000 1, 表明模型显著，失拟项P=0.395 9 表示失拟项不显著，决定系数R2=0.989 9 接近R2adj=0.979 8，证明该模型是可靠的；对模型进行回归方程系数显著性检验，得到模型的一次项A、B、C 是极显著的，说明提取温度、提取时间、料液比对多糖的提取率有显著影响。F值表示因素对多糖提取率的影响程度，从方差分析表中F值大小可以判断各因素对试验结果影响的程度，F值越大，因素对多糖提取率的影响越大。因此可得到各因素对多糖提取率从大到小的影响顺序次序是：C（料液比）> A（提取温度）> B（提取时间）> D（颗粒大小）。

2.2.2 响应面各因素交互作用分析 由图2 可知，AB、AC、BC、CD 响应面都是向下开放的，并且曲面陡峭。AC、BC、CD 等高线图沿着料液比向等高线相对密集，响应面图以及等高线图表明料液比对多糖提取率的影响比提取温度、提取时间及颗粒大小大。等高线呈现椭圆形，表明AC、BC、CD 有明显的交互作用；AB 等高线图沿着提取温度向等高线相对密集，表明与提取时间相比较，提取温度对HCP 的影响更大。AD、BD 两个响应面图曲面向下开发，但等高线图中的等高线较为稀疏并且其中心没有呈现椭圆形，颜色变化缓慢，表明两者交互作用不显著。各因素交互作用对HCP 提取率影响的响应面图和等高线图分析结果与方差分析一致。

图2 各因素交互作用对珊瑚状猴头菇多糖提取率影响的响应面图和等高线图Fig. 2 Response surface diagram and contour map of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of HCP

2.2.3 优化提取工艺参数的验证 通过Design‑Expert 8.0.6 软件分析，获得珊瑚状猴头菇多糖的最佳水提条件：提取温度93.34℃、提取时间2.06h、料液比1∶33.5（g/mL）、颗粒大小80.15 目，在此条件下，HCP 的提取率最高，粗多糖预测值为11.14%。考虑实际操作，在提取温度93℃、提取时间2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、颗粒大小80 目的条件下做验证试验。经3 次重复试验，得到实际粗多糖的提取率为11.02%，相对误差小于1%，表明此模型可以更好地反映HCP 的提取率与影响因素之间的关系，由此可以确定HCP 最佳提取工艺条件。

2.3 HCP的化学成分分析

粗多糖经成分分析（表4）显示，总糖含量为65.21%±0.90%，糖醛酸含量13.52%±1.95%，含有极少量的蛋白质。

表4 HCP 的化学成分Table 4 Chemical composition of HCP%

2.4 HCP紫外光谱分析结果

如图3 所示，HCP 在198 nm 处有多糖特征吸收峰，260 nm 和280 nm 附近有细微杂峰，表明HCP含有少量核酸和蛋白质。

图3 HCP 的紫外吸收光谱图Fig. 3 UV absorption spectrum of HCP

2.5 HCP红外光谱分析结果

如图4 所示，在3 417 cm-1附近的吸收峰为O‑H伸缩振动；在2 931 cm-1附近的吸收峰是C‑H 伸缩振动产生这两个是多糖类化合物的特征吸收峰［23］。在1 651 cm-1附近的吸收峰显示为糖醛酸中的C=O拉伸振动，说明该物质中可能含有糖醛酸；在1 411 cm-1附近显示为C‑H 变形振动吸收峰；在1 080 cm-1附近的特征吸收峰表明HCP 可能存在吡喃糖环，在1 249 cm-1附近的特征吸收峰表示HCP 含有C‑O 糖苷键。综上所述，是典型的多糖类物质并且具有吡喃糖环结构。

图4 HCP 的傅里叶变换红外吸收光谱图Fig. 4 Fourier transform infrared absorption spectrogram of HCP

2.6 XRD分析

由图5 可知，HCP 在θ=20°处附近有一个强烈凸起的宽衍射峰，表明HCP 结晶度较低，同时存在无定形和结晶部分。

图5 HCP 的XRD 谱图Fig. 5 XRD spectra of HCP

2.7 珊瑚状猴头菇粗多糖的体外抗氧化活性

2.7.1 DPPH 自由基清除能力 如图6 所示，在0-2.5 mg/mL 范围内，HCP 质量浓度的增加，对DPPH 自由基的清除能力从40.03%±4.23%增加到87.02%±2.24%呈现先增加后趋于稳定的趋势。从质量浓度的角度考虑，HCP 清除DPPH 自由基的能力要弱于阳性对照组VC。HCP 对DPPH 自由基的EC50值为0.663 mg/mL。

图6 HCP 对DPPH 自由基清除率Fig. 6 Scavenging rate of DPPH free radical to HCP

2.7.2 ABTS+自由基清除能力 如图7 所示，HCP对ABTS+自由基的清除能力存在剂量关系，HCP对ABTS+自由基的清除能力随着多糖质量浓度的增大而增加；当质量浓度为2.5 mg/mL 时，HCP 表现出最强清除活性，对ABTS+自由基的清除率达到98.27%±0.73%接近阳性对照VC。HCP 对ABTS+自由基的EC50值为0.767 mg/mL。

图7 HCP 对ABTS+自由基清除率Fig. 7 Scavenging rate of HCP to ABTS+ free radical

2.7.3 羟自由基清除能力 如图8 所示，HCP 对羟自由基的清除能力具有依赖关系，在0-2.5 mg/mL 范围内，其清除率从23.99%±1.51%增加到87.65%±0.75%。与阳性对照VC相比，HCP 对·OH 自由基的清除活性相对较弱，其EC50值为0.952 mg/mL。

图8 HCP 对羟自由基清除率Fig. 8 Scavenging rate of HCP free radical to OH

3 讨论

真菌多糖常用的提取方法有热水提取法、超声提取法、酶提取法等，但大多数真菌多糖在热水中溶出率较高，而且对多糖活性影响较小［24］。因此本试验采用水提醇沉法提取珊瑚状猴头菇多糖。热水法提取多糖的提取率与温度、时间、料液比、颗粒大小等条件有着密切的关系。因此，本研究在单因素试验的基础上，对这些因素进行了响应面优化试验，根据二次模型的响应面图以及等高线图评价了试验因素对HCP 提取率的两两交互作用，结果表明各因素对HCP 提取率的影响强弱顺序为：料液比>提取温度> 提取时间> 颗粒大小，与胡丽玲等［25］研究一致。料液比对HCP 提取率的影响最大，胡瑞财等［26］研究表明灵芝多糖最佳料液比为1∶30（g/mL），与本研究测定结果一致；可能是因为料液比过小会限制HCP 的溶出［27］，但随着溶液体积的增大，其他水溶性杂质会析出，降低水提液中的固形物含量，加大后期除蛋白工艺的难度［22］。其次是提取温度，提取温度会直接影响多糖在水中的溶解度，多糖提取率随着温度的升高而升高，白凤岐等［28］对灵芝多糖的研究表明在90-100℃提取率最高，与本研究相似，但由于沸水提取对工业设备要求高［29］，因此选择90℃为最适温度。提取时间过长，多糖的结构可能遭到破坏，从而导致多糖提取率降低［22］；颗粒过粗，多糖溶出不充分，颗粒研磨过细，颗粒容易成团，传质阻力增加促使传质速率降低，不利于多糖分子的溶出［30-31］。研究表明HCP在此优化提取参数条件下，提取率为11.02%，与游贤珍［32］提取滑菇多糖研究结果相比，HCP 提取率较高，说明本试验水提多糖最佳提取工艺参数可靠。

UV‑Vis 在190-200 nm、260 nm 和280 nm 附近分别为多糖、核酸和蛋白质的特征吸收峰；HCP在198 nm 处有最大吸收峰，符合多糖的特征曲线；280 nm 存在极其微小的弱峰，表明HCP 含有少量的蛋白质，进一步采用双缩脲法测定HCP 中蛋白质含量，其含量为5.28%±0.50%，证明HCP 确实含有少量蛋白质。XRD 可以对样品进行物相定性，可精准测定样品的晶体结构、结晶度等性质［33］；且多糖的结晶结构特征直接决定其抗张强度、柔韧性、溶解性、膨胀性和其他物理性质［34］；本研究表明HCP 为半结晶聚合物，与Peng 等［35］研究竹笋壳多糖结果相似。FI‑IR 可以分析化合物的存在，多糖在4 000-400 cm-1范围内有特征吸收峰，HCP 在此范围内有多糖的特征吸收峰并且含有糖醛酸和吡喃糖环结构。

自由基会破坏体内蛋白质和酶，引起机体炎症和衰老，清除自由基可以保护机体免受氧化损伤［36］。猴头菇多糖具有良好的抗氧化作用，黄越等［37］研究发现，猴头菇粗多糖质量浓度为5 mg/mL 时，对DPPH 和·OH 自由基的清除能力为72%和75%；对ABTS＋自由基的清除效果为85%（0.5 mg/mL）。本研究结果显示，当HCP 质量浓度为2.5 mg/mL时，对DPPH、ABTS+、·OH 自由基清除能力分别为87.02%±2.24%、98.27%±0.73%、87.65%±0.75%。两者相比，珊瑚状猴头菇粗多糖对DPPH、·OH 自由基的清除作用强于猴头菇粗多糖，对ABTS+自由基的清除能力弱于猴头菇粗多糖，可能因为品种不同，不同提取方法所提取的多糖，其糖醛酸、分子量等结构不同，导致抗氧化效果有所差异。大量研究证明多糖的抗氧化活性可能与其结构有关，Liu等［38］从金针菇菌渣中提取的中性多糖和酸性多糖，研究这两种多糖对ABTS+自由基的清除效果，结果表明酸性多糖的抗氧化作用优于中性多糖，认为可能是因为酸性多糖含有更多的糖醛酸和硫酸盐；Leng 等［39］研究酿酒葡萄多糖的抗氧化活性发现Moldova（MD）品种的葡萄多糖分子量较低，糖醛酸含量较高，具有较强的抗氧化活性。综上所述，HCP 具有良好的体外抗氧化活性，可进一步在动物体内探究其抗氧化活性和其他功能。

4 结论

本研究通过响应面法得到HCP 最佳水提工艺条件：提取温度93℃、提取时间2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、颗粒大小80 目。HCP 体外抗氧化试验表明，在一定浓度范围内，对DPPH、ABTS+、·OH 自由基具有良好的清除效果。