基于网络药理学和分子对接技术探讨土茯苓治疗痛风的机制研究

胡文仲,樊一桦,许 云,梅 曼,吕 柳

(1. 中国中医科学院广安门医院南区,北京 102600;2. 成都中医药大学附属医院,四川 成都 610072;3. 北京市大兴区人民医院,北京 102600;4. 北京中医药大学东直门医院,北京 100700)

痛风是一种嘌呤代谢紊乱引起尿酸生成增多和/或尿酸排泄减少导致的代谢性疾病,已成为慢性肾病、冠心病、糖尿病、脑卒中等疾病的独立危险因素[1]。西医促进尿酸排泄、抑制尿酸生成等治疗虽有靶点精准、起效快速的优势,但对不同阶段病理改变的治疗针对性不强,且长期服用易发生严重皮肤不良反应、胃肠道损害、肝肾功能损害和心血管疾病风险,增加了临床用药的风险[2-4]。土茯苓(百合科植物)是一种传统中药,《本草纲目》记载其具有“除湿、解毒、通腑”的功效,土茯苓主要含有黄酮类成分,具有抗炎、镇痛和抑制肾间质纤维化的作用[5-6]。与非甾体抗炎药相比,黄酮类药物毒性较小或无毒,有证据支持黄酮类药物的安全性[7-8]。网络药理学是结合医学和计算机网络,基于网络分析技术对复杂的生物系统进行检测和分析,筛选出潜在的活性成分,并预测相关疾病的作用靶点[9],通过构建中医药“化学成分-作用靶点-疾病靶点-PPI网络”多维网络,从分子水平解释中医药的作用原理,为中医药治疗各种疾病的生物学靶点和潜在作用机制提供了有力的证据[10-11],分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法,主要研究分子间的相互作用,预测分子间的结合方式和亲和力[12]。本研究试图利用网络药理学和分子对接来阐明土茯苓在痛风治疗中的作用靶点和作用机制。

1 方 法

1.1活性成分的筛选 从中药系统药理学数据库(TCMSP)中检索到土茯苓的主要化学成分(https://tcmspw.com/index.php)。TCMSP数据库是一个独特的平台,用于分析中草药的活性成分及其在特定疾病中的相互作用[13],并提供每种成分的药代动力学信息,如药物相似性(DL)和口服生物利用度(OB)。OB是口服药物进入血液循环的相对数量和速率。当OB值低于30%时,中药的大部分成分很难到达特定组织并发挥相应的药理作用[14]。DL是一个基于现有药物的物理化学性质和分子结构的概念。它被用来评价一种成分是否有资格成为新药。因此,OB和DL是鉴定和评价药物活性成分的重要药代动力学参数。TCMSP数据库推荐的OB≥30%和DL≥0.18的成分被认为是有效的。以土茯苓根状茎为检索词,获得活性成分的药代动力学信息。

1.2筛选蛋白质靶点 TCMSP数据库不仅可以让用户分析和鉴定草药中的活性成分,还可以搜索活性成分的相关蛋白质靶点。将这些蛋白质靶点输入UniProt数据库(https://www.uniprot.org),这是一个蛋白质数据库,包含了丰富的信息,包括基因名称、基因ID和基因符号。笔者将物种限制在“人类”身上,并将他们转化为标准基因简称,从UniProtKB中提取到相应的基因名。

1.3痛风相关靶点及土茯苓对痛风的潜在靶点预测 从Genecards、OMIM、PharmGKB、Drugbank和TTD 5个数据库中获得痛风的靶点。在5个数据库中搜索关键词“Gout”获得疾病靶点,将活性成分靶点与潜在的疾病相关靶点交叉,得到土茯苓的潜在抗痛风靶点。

1.4PPI网络的构建与拓扑分析 PPI数据库用于PPI网络构建(https://string-db.org/),将UniProt转换后的潜在靶基因名输入,生物种属仅限于“人”,去除离散基因后提取PPI网络,笔者将相关度设置为大于或等于0.400。利用Cytoscape软件(版本3.8.0)进行PPI网络可视化,完成拓扑分析,有助于识别土茯苓的关键靶点,突出土茯苓抗痛风的核心基因。

1.5GO与KEGG分析 在成功构建PPI网络后导入R软件,利用生物导体包clusterprofile进行GO和KEGG富集分析,获得生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)和关键信号通路,设置阈值校正P<0.05。KEGG富集结果筛选出核心途径,并对疾病途径进行了定位。

1.6分子对接验证组分-靶相互作用 分子对接技术是基于“键锁原理”来反映小分子配体与蛋白质受体之间的结合。小分子配体的结构来源于PubChem(https://publichem.ncbi.nlm.nih.gov/)。数据库并保存为mol2格式。从RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/,最后访问日期:2021年12月28日)下载蛋白质受体的晶体结构。在PyMOL软件中将受体去除水分子,制备和能量最小化有关的受体蛋白网格。

2 结 果

2.1活性成分 在TCMSP数据库中输入中药名称,检索土茯苓的433个成分。根据OB≥30%、DL≥0.18的筛选标准,得到槲皮素、紫杉醇、薯蓣皂苷、落新妇苷、β-谷甾醇、槲皮素等15种有效成分。见表1。

表1 土茯苓活性成分基本情况

2.2土茯苓作用靶点 本研究共发现904个土茯苓预测靶点,删除重复后最终获得203个土茯苓作用靶点。

2.3痛风相关靶点及土茯苓对痛风的潜在靶点从GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank和TTD数据库中检索到891个痛风相关基因靶点。此外,将土茯苓的预测靶点与痛风基因靶点结合,获得57个预测靶点(见图1)。例如,IL1B、CXCL8、PPARG和CCL2是土茯苓和痛风之间密切相关的靶点(见表2)。

图1 痛风基因靶点和土茯苓预测靶点的交集图

表2 土茯苓抗痛风的潜在目标

2.4网络构建分析

2.4.1中药调控网络分析 中药调控网络包含13个组分,调控57个靶点(70个节点,107个边缘)。在组分靶网络中可以看到一些组分可以作用于多个假定的靶点(如槲皮素作用于48个潜在靶点,柚皮素作用于14个潜在靶点,β-谷甾醇作用于9个靶点等)。有些成分只作用于少数靶点,如neostilbin 和TOP2B,也可以从网络中看出,有些靶点可以被多种成分调控,可能在疾病的治疗中发挥重要作用。例如:前列腺素内过氧化物酶(PTGS)又称环氧合酶,是前列腺素生物合成的关键酶,发现PTGS1和PTGS2分别受84.6%和69.2%的土茯苓成分调控。有些靶点只受一种成分的调控,如ABCC1、CCL2、XDH等。见图2。

图2 土茯苓复合物网络与潜在靶点

2.4.2PPI网络建设 将57个核心基因靶点构建PPI网络,最终得到包含57个节点和530条边的PPI网络。基于STRING数据库和Cytoscape软件,获得了一个包含17个核心基因靶点的核心网络(见图3)。本研究中获得的核心基因靶点包括VEGFA,ICAM1,BCL2L1,MAPK3,CRP,STAT1,IL10,CCL2,IL6,FOS,EGF,IL1B,RELA,JUN,PPARG,PTGS2和CXCL8。

2.5富集分析 采用GO和KEGG富集分析(P<0.05),GO分析结果显示前10个相关信息(见图4)。KEGG富集分析显示,抗痛风的土茯苓可能参与糖尿病并发症中的年龄信号通路(BCL2/JUN/PRKCA/TGFB1/RELA/MAPK3/ICAM1/VEGFA/IL-6/STAT1/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL8/THBD/IL1A,计数16),类风湿关节炎(JUN/TGFB1/IFNG/ICAM1/VEGFA/MMP3/FOS/IL6/MMP1/IL1B/CCL-2/CXCL8/IL1A/CXCL2,计数14),IL-17信号通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/IFNG/MMP3/FOS/M-MP9/IL6/MMP1/IL1B/CCL2/CXCL8/CXCL2,计数14),TNF信号通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/ICAM1/MMP3/FOS/MMP9/IL6/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL2,计数13)和流体剪切应力与动脉粥样硬化(BCL2/JUN/RELA/IFNG/ICAM1/VEGFA/FOS/MMP9/IL1B/CCL2/VCAM1/THBD/IL1A,计数13)等(见图5)。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集分析

2.6目标和成分之间的分子对接 槲皮素活性最好,与痛风的7个核心靶点对接良好。亲和力越低,结构越稳定。其亲和力为:槲皮素和IL1B(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和CXCL8(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和PPARG(-8.6 kcal/mol)、槲皮素和CCL2(-6.4 kcal/mol),槲皮素与PTGS2(-9.2 kcal/mol)、槲皮素与IL6(-7.8 kcal/mol)、槲皮素与STAT1(-7.3 kcal/mol),笔者将上述7对基因组分放入PyMOL(版本3.8.0)进行可视化(见图6)。

(a) 槲皮素和IL1B;(b)槲皮素和CXCL8;(c)槲皮素和PPARG;(d)槲皮素和CCL2;(e)槲皮素和PTGS2;(f)槲皮素和IL6;(g)槲皮素和STAT1图6 目标和成分之间的分子对接

3 讨 论

网络药理学是分析中医药治疗和预防各种疾病的潜在生物学机制的合理方法[15]。已有研究证实土茯苓在痛风的治疗中起重要作用[16],但其作用机制尚不完全清楚。因此,笔者首次采用网络药理学方法结合分子对接技术系统地揭示了土茯苓抗痛风的作用机制。

槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇是土茯苓治疗痛风的重要活性成分。槲皮素是一种生物类黄酮,能有效抑制单钠尿酸盐(MSU)诱导的痛风模型小鼠滑膜炎,减轻关节水肿[17],研究人员证实槲皮素通过阻止MSU晶体激活NLRP3炎性体,降低IL-1β水平,从而减少炎性细胞浸润[18],此外,槲皮素还可以直接抑制炎症细胞浸润,抑制环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的产生以达到抗炎作用[19-20],可以降低正常和高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平,并且降低能力与血尿酸水平成正比[21]。

柚皮素具有破坏MSU诱导的促炎症/毒性细胞因子产生的能力,能抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10的产生和NF-κB的活化,对痛风具有抗炎、镇痛、抗氧化作用,不会引起肝肾损害[22]。Domiciano等[23]认为柚皮素是MSU相关吞噬诱导的NLRP3炎症体激活/IL-1β释放的选择性抑制剂,中性粒细胞募集在炎症关节产生大量的氧和氮活性物质,攻击和损伤关节[24-25],柚皮素能诱导结缔组织结构的降解,促进关节退行性变[26],一方面能减少超氧阴离子和亚硝酸盐的产生,另一方面也能促进关节退行性变,它可以通过增加内源性抗氧化剂GSH的抗氧化活性来抑制MSU诱导的组织氧化[27]。

β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一,前期的研究表明其具有抗炎、镇痛、抑制肿瘤、免疫调节、防治前列腺肥大、抗氧化、抗高血脂、促进伤口愈合等广泛的药理活性[28-29]。在这里要特别提到β-谷甾醇的另一个重要特性--抗溃疡、保护胃黏膜,有研究证明β-谷甾醇抗胃溃疡的特性不依赖于前列腺素,可能是通过降低 TNF-α水平(巨噬细胞一旦激活,组织中就分泌大量的TNF-α),即降低了胃黏膜组织中炎性因子的释放与聚集,减缓了受损胃黏膜组织的进一步恶化,提高受损胃黏膜的修复能力。同时提高了大鼠体内氧自由基(OFR)的清除能力,从而降低了OFR对胃黏膜的损伤作用。这一特点无疑是痛风患者的福音,这似乎可以解释为什么土茯苓可以更加安全地用于痛风患者。

CXCL8是CXC亚族的典型趋化因子[30-32]。研究已发现在痛风急性和亚急性阶段CXCL8的水平增加,但并不是通过激活IL-1β途径,这可能与巨噬细胞和树突状细胞激活产生CXCL8直接相关[33-34]。越来越多的证据表明CXCL8是心脑血管、糖尿病、肾脏等疾病的独立预测因子[35-36],因此CXCL8已逐渐被认为是肥胖和代谢并发症的标志物。近年来,越来越多的研究表明CXCL8的参与对于土茯苓改善痛风患者病情,降低尿酸水平、关节炎症、改善内环境、降低心脑血管风险等方面具有重要的作用[33,37-38]。

KEGG富集分析表明,土茯苓可能参与IL-17信号通路、TNF信号通路、体液剪切应力和痛风的AGE-RAGE信号通路。痛风急性发作依赖于单钠诱导的多种炎症途径的激活尿酸盐晶体(MSU)和巨噬细胞参与的NF-κB等炎症小体相关的细胞内信号转导[39-40]。最后,激活的IL-1β被释放,以诱导中性粒细胞募集和释放更多的炎症介质,导致炎症级联反应[41-42]。从这个意义上说,靶向与NF-κB炎症体相关的细胞内信号通路可能是控制痛风的一种潜在形式。通过KEGG富集分析,笔者选择IL-17信号通路来定位疾病通路(见图7),其中红色标记的基因或蛋白与土茯苓有效成分的抗痛风核心靶点相关,涉及靶点包括NF-κB、CXCL8、COX2(PTGS2)、IL1B等。图6提出了槲皮素作为最具活性的组分,并将其与潜在靶点进行了分子对接。良好的对接靶点是IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1。细胞因子,特别是IL-1B、IL-6和PTGS2的表达已被广泛认为是痛风的主要致病因素。通过分子对接,笔者发现土茯苓能与这3个基因靶点有效对接,形成不同数量的H-键复合物,从而在抗炎和疾病进展中发挥稳定的作用。与槲皮素对接的另一个好靶点是C-C基序趋化因子配体2(CCL2),CCL2由滑膜细胞产生,它是单核细胞/巨噬细胞募集的关键局部趋化剂,与尿酸水平成正比[43-46]。一项涉及中国沿海地区二千多名男性的研究发现,CCL2-2518 A/g基因型分布与痛风相关,A/g等位基因具有更高的痛风风险[47]。因此,有理由推测土茯苓的抗痛风机制是通过槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇等主要成分,作用于IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1靶点和多种途径(糖尿病并发症中的年龄-年龄信号通路、类风湿关节炎、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和流体剪切应力与动脉粥样硬化)。

中医药对痛风的认识已有数千年的历史,土茯苓是百合科植物光叶土茯苓的干燥根茎,是一种具有代表性的多途径抗痛风的药物,临床应用十分广泛。本研究首次运用网络药理学系统构建了一个综合分析平台,包括靶点预测、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、拓扑分析、基因富集分析和分子对接。利用这个平台,本研究揭示了土茯苓抗痛风的潜在机制,并探讨了槲皮素在痛风防治中的应用可能。此外,通过分子对接对结果进行了进一步的验证和评价。本研究证明网络药理学联合分子对接技术对理解中医药的整体观念、中药药理学以及探索中医药的多适应证特性有着重要的现实意义。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。