新型Argonaute蛋白的挖掘及体外活性表征

方蒙君， 司振军， 沈培杰， 黄 迪， 徐志南

（浙江大学 化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310000）

Argonaute 蛋白（Agos）广泛存在于原核和真核生物中[1]，可以通过短核苷酸的介导来结合或切割与其序列互补的核酸分子[2]。真核生物来源的Agos（eukaryotic Agos，eAgos）是RNA 干扰途径（RNA interference，RNAi）中的主要组成部分，用于调控基因的表达和抵抗病毒的入侵[3-5]。而原核生物来源的Agos（prokaryotic Agos，pAgos）也有免疫功能，可以降解入侵的遗传元件，如质粒和噬菌体核酸等[6-7]。

eAgos主要通过RNA的介导特异性切割RNA分子，而pAgos则更偏好以单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）为导向切割DNA 靶标[8-9]。然而随着研究的深入，越来越多具有多样功能的pAgos 引起了人们的注意。例如，来自Kurthia massiliensis的KmAgo[10-11]和Marinitoga piezophila的MpAgo[12]可以通过ssDNA 或RNA的介导切割DNA和RNA底物。除了导向核酸类型之外，pAgos的核酸酶活性还受导向的5末端修饰基团的影响。大多数pAgos偏好具有5末端磷酸基团的导向核酸，此时切割位点位于导向的第10-11位碱基对应的磷酸二酯键[13]。而某些pAgos也可利用5′末端为羟基的核酸为导向，此时切割位点会发生迁移，位于第11-12位碱基之间[10]。

pAgos的可编码核酸内切酶活性使得它在核酸操作领域，例如基因组编辑[14-15]、人工限制性核酸内切酶开发[16]和核酸检测[17]等，具有广阔的应用前景。然而，目前只有少数几种pAgos的酶学性质、催化机理和结构进行了研究分析。因此，对于新型pAgos的挖掘和研究不仅可以深化我们对Agos的了解，还可以为核酸操作领域提供更多的工具蛋白。本研究通过在NCBI中比对已报道的、具有核酸酶活性的pAgos序列，获得了一些同源性较高的新型pAgos，并对其进行了表达纯化和体外活性验证，为后续的pAgos研究工作提供了新的参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基LB培养基：10 g/L氯化钠、5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨（固体培养基再添加1.5%的琼脂粉）；TB培养基：24 g/L酵母提取物、12 g/L蛋白胨、12.5 g/L磷酸氢二钾、2.3 g/L磷酸二氢钾、4 g/L甘油。

1.1.2 商品化试剂

Bradford 蛋白浓度测定试剂盒，翌圣生物，货号20202ES86；2 × SSCP去离子甲酰胺凝胶上样缓冲液，上海生工，货号B548；4 × Protein SDS-PAGE Loading Buffer，TaKaRa，货号9173；Acryl/Bis 40% Solution，37.5∶1，上海生工，货号B54601；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，上海生工，货号B528419-0005。

1.1.3 SDS-PAGE试剂

15%分离胶：3.867 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、2.533 mL Tris-HCl（1.5 mol/L，pH8.8）、100 µL 10% APS、100 µL 10% SDS、10 µL TEMED，去离子水补充至10 mL；5%浓缩胶：0.62 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、0.62 mL Tris-HCl（1 mol/L，pH6.8）、50 µL 10% APS、50 µL 10% SDS、4 µL TEMED，去离子水补充至5 mL；5×SDS-PAGE 电泳缓冲液：0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L glycine、0.5% SDS；染色液：80 mL 去离子水、100 mL甲醇、20 mL乙酸、0.5 g考马斯R-250；脱色液：600 mL去离子水、300 mL甲醇、100 mL乙酸。

1.1.4 尿素-PAGE试剂

10×TBE：108 g/L Tris、55 g/L 硼酸、7.44 g/L 二水合Na2EDTA；14%尿素-PAGE 配方：4.2 g 尿素、3.5 mL Acryl/Bis 40% Solution（37.5∶1）、1 mL 10×TBE、100 µL 10% APS、10 µL TEMED，去离子水补充至10 mL。

1.1.5 亲和纯化试剂破胞缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑，pH7.5；洗脱缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH7.5；蛋白保存缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L KCl，pH7.5。

1.1.6 寡核苷酸序列

FAM-tDNA：FAM-aaaataatttaatatactatacaacctactacctcttata；

FAM-tRNA：FAM-aaaauaauuuaauauacuauacaaccuacuaccucuuaua；

P/OH-gDNA：P/OH-tgaggtagtaggttgtata；

P/OH-gRNA：P/OH-gagguaguagguuguaua。

1.1.7 氨基酸序列

TtrAgo（Thermococcus thioreducens）：MLMKVLTNMVKLNQDIIPNEIYLYKIFNKPEDGMNIYKIAYRNHGIVI DPQNRIIATPSELEYSGKFAIEDEISFNELPENYQNRLVLRILRDNGISDHALSRTLQKYRKPKPFGDFEVIPEIRSS VIKHGGDFYLVLHLSHQIRSKKTLWELVGRNKDALRDFLKEHRGTILLRDIASEHKVVYKPIFKRYNGDPDLIED NSNDVEHWYDYHLERYWNTPELKKEFYKKFGPVDLNQPIILAKPLRQHNRGDLVHLLPQFVVPVYNAEQLNDI LASEILEYLKLTSNQRISLLSRLINDIKTNTNIIVSSLTELEANTFDVDLNDMLQVRNADNVKVTLSELEISKTRLFTW MKSRKYPVILPYDIPQKLKKIEKIPVFIIVDSALSRDIQTFAKDEFRYLISSLQKSLSNWVDFPILDIRDKYIFTIDLTS DKDIVNLSIKLVNLMKNAELGLALIATRTKLPNETFDEVKKRLFSVNIISQVVNEATLYKRDKYNESRLNLYVQH NLLFQILSKLGIKYYVLRHKFSYDYIVGIDVTPMKLSHGYIGGSAVMFDSQGYIRKIIPVEIGEQMGESIDMKEFFK DMVVQFGKFGIDLEGKSILILRDGKITKDEEEGLAYISKVFGIKITTFNIVKRHLLRIFANRKLYLRLANSVYLLPH RIKQSVGTPVPLKLSEKRLILDGTITSQEITYNDIFEILLLSELNYGSISADMKLPAPVHYAHKFVRALRKGWRIRE ELLAEGFLYFV；

TeAgo（Thermococcus eurythermalis）：MNIDEYQTNMYKIKSSIVKEAFSDLVSVEILLGQKLNHREIYRIVQGK FGGLVYKHDEMLGKVVAVIKEEYISELENEPEIQVLSIQAFDVSSLDKNKREKLLLNILKKKGHLFQILRHKQVIG KIENRTIRRTFRVSIESEGKEYYIVVLPRHEIIEDSTIMDLLIKGELTIEDLKINLIEKGTWKITSFRKDIDVSPNAVE EIILKVEDPSRYNAELKRINEYFITRTSLEPIDDSKYPDKYNMILITKGKRYSYHPSRAMLIRPVEGELQKKIHHSG EFLKALNIAAEYIKDIIETSKRATFEGVQIPSQDIYYKATFLENGRIIRKKIAPYYNIKNTFNWLFKNEPFEKTYSLI VPTKTPKFIKDKKIAIYLLYPKEFSKERTTLVSDVKSALDRVSEYFAYLRTISMTSSLSLPVEITTPLIAVDYTNLAQ RLTKIFEKYENYDYHLAITFVPSMSREQFDRIKKFFFERGIIHKAINIDNLNSKFGKNKQRIIESVILQALYAFGIYF YSLDNLPYDIIIGIDVTREKDKNGKYYGISGAAVVQNKNGEIIKIVPITQPQSSSETVDVEKIFESLQPELDQIVETKS NVDILILRDGRIPSREIEQLKRLSLRRPYTFTLVGIIKRPLVRFFKGTDRHLFGPKPNYYFRIGDTYYLTSHFLEHYL KVPLKLERKYVISRGKLATSPLNHEDILAITKLTKLNYSQPKNPDRMKLPAPVHLSHRLINYERRGLRFARPEFLQ EGALYFL；

DeAgo（Domibacillus enclensis）：MEPYITEATAIGLASDIHLHVYEFPVDNPLKKYEGVSDICREWKRANGYM AVAYNQSTIATLEPVVNYAGFEPLSYQEKPIDPDNPFERSLLERLLKEGLLTAGQQKLKLKRVGADLQEWEPKRV GRILIYPALSFHVNVLNNRVHIGFAMTHKFEYEVTLQQMLEQGEVVEEGLKVVHSDVWNNYTYEVEQIAPYSVM DMCPKLKKPIHQYYVDKGNQKMADTLHENVKVIYAKPLHGDSLSYAASVLKPLCSFETMKPFEAKKIMDVLKLK PDERMRKQLEQAKKLLSVFSYLQFEKRPFLLQANQYELMTLSEPAVFTNKRFNKPIYGLKNGPLFKGGTVTLSIFF DEAIESSLGLSKKLVFQFVKVLQKIAEQNGVIMKISHETKHIKGKLNESFFQHFSWEIRELENVFTDTTVLALMTEE HLTKLPNKLYNEFKRQFGGKWDISSQIITEKVLKTFQYALTRHQLTDFNVNDEKECERVADIVKNDSLSYPVFNIL LGIYVKSGMQPWVLAERAHSDCFIGLDVSHEDGKSAAGIMNVIGSNGHLIKQSALNGVLAGEKIDEPTLNEIITEV LYSYQKQFGHFPKHVTIHRDGKWRESSELVGRLFKDRNVAYDIVEVIKKPNRRMAFYNNETGKFETKQGVCYV RNQEAFLCSTNPRETIGMAQPVKIVQLTNTLPFKQIIQDCYDLSFMHIHAVNKMRLPATIHYADLSSTAYQRGQVA PRTTNGTHLPFV；

MhAgo（Marinitoga hydrogenitolerans）：MYLNLYEIKIPYRVKRLYYFNKENDPKEFARNLSRVNNIRFNDSKD LVWLEIPDIDFKITPQQAEKYKIEKNEIIGEKEDSDLFVKTIYRYIKKKFIDNNFYYKRGNNYISINDKFPLDSNTNV NAHLTYKIKLYKINERYYISVLPKFTFLSDKPALESPIKSTYLFNIKSGKTFPYISGLNGVLKIDLGENGIKEVLFPEN YYFNFTSKEAEKFGFSKEIHNIYKEKIFSGYKKIKQSLYFLEDIININNYNLTMDKKIYVNIEYEFKKGISRNIKDVF KYSFYKNDQKIKIAFFFSSKKQIYEIQRSLKMLFQNKNSIFYQTIYEMGFSKVIFLREPKTNSSAFMYNPETFEISNK DFFENLEGNIMAIIILDKFLGNIDSLIQKFPENLILQPILKEKLEKIQPYIIKSYVYKMGNFIPECQPYVIRNLKDKNK TLYIGIDLSHDNYLKKSNLAISAVNNFGDIIYLNKYKNLELNEKMNLDIVEKEYIQILNEYYERNKNYPENIIVLRD GRYLEDIEIIKNILNIENIKYSLIEVNKSVNINSCEDLKEWIIKLSDNNFIYYPKTYFNQKGVEIKIIENNTDYNNEKIL EQVYSLTRVVHPTPYVNYRLPYPLQVVNKVALTELEWKLYIPYMK。

1.2 方法

1.2.1 新型pAgos的筛选

分别使用PfAgo（NCBI 序列号：WP_011011654.1）、MpAgo（NCBI 序列号：WP_014295921.1）或KmAgo（NCBI序列号：WP_010289662.1）的氨基酸序列在NCBI中进行序列比对。

1.2.2 系统发育树构建

使用MEGA7.0软件比对和分析了4个候选蛋白以及已报道的活性pAgos的氨基酸序列，并以此构建了系统发育树，其中序列比对采取MUSCLE算法，进化树构建则选择Neighbor-Joining方法。

1.2.3 pAgos表达载体的构建

以大肠杆菌为表达系统，对候选pAgos的基因进行密码子优化。蛋白纯化采取亲和层析，因此在目的蛋白的N 端添加6 个组氨酸，委托金斯瑞公司合成设计好的基因。表达载体选择pET28a，基因插入位点为NcoI 和EcoRI。4 个pAgos 表达质粒分别命名为pET28a-TtrAgo、pET28a-TeAgo、pET28a-MhAgo、pET28a-DeAgo。

1.2.4 质粒的转化

从-80 ℃冰箱中取出4 支大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将其放置于冰上5 min；分别加入100 ng 的pAgos质粒，用枪头轻轻搅动后放置于冰上30 min；将细胞转移到42 ℃水浴锅中进行90 s热击；将细胞转移到冰上，静置3 min后加入900 µL新鲜的LB培养基，转移至37 ℃、220 r/min 摇床复苏1 h；取100 µL复苏后的细胞，涂布在含有50 ng/µL卡那霉素的LB固体平板上，在37 ℃下倒置培养12～16 h。转化后的菌株分别命名为BL21（DE3）/pET28a-TtrAgo、BL21（DE3）/pET28a-TeAgo、BL21（DE3）/pET28a-MhAgo、BL21（DE3）/pET28a-DeAgo。

1.2.5 pAgos的表达

使用牙签挑取上一步质粒转化所得的单菌落，放入5 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养12 h；取2 mL 种子液，接种于200 mL TB 液体培养基中，37 ℃、220 r/min 培养至OD600为2.0 ～ 3.0；加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 溶液，25 ℃、220 r/min 培养12 h；将菌液转移至50 mL 离心管中，5000 r/min 条件下离心10 min，倒掉上清液，收集的菌体可用于后续纯化或保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 SDS-PAGE验证pAgos的表达

取1 mL发酵菌液，12 000 r/min条件下离心1 min，倒掉上清液；加入1 mL去离子水重悬菌体，12 000 r/min离心1 min，倒掉上清液；加入适量体积的破胞缓冲液，调整菌液的OD600约为5；取0.5 mL上一步骤的菌液放入2 mL EP管中，冰浴条件下进行超声破胞（3 s工作，7 s间隙，20次循环，工作功率为250 W）；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取15 µL上清液与5 µL 4 × loading buffer混合，作为可溶表达样本；在沉淀中加入1 mL去离子水清洗，12 000 r/min离心10 min，倒掉上清液；加入0.5 mL 8 mol/L尿素溶液重悬菌体，取15 µL与5 µL 4×loading buffer混合，作为包涵体样本；将可溶表达和包涵体样本在沸水中煮5 min后，取10 µL样品进行电泳（120 V、90 min）；将凝胶放入染色液中，在水平旋转振荡仪中染色30 min；倒掉染色液，加入脱色液振荡，至脱色完全；加入清水，振荡30 min后记录结果。

1.2.7 pAgos的纯化

取出发酵后的菌体，加入适量体积的破胞缓冲液，调整菌液的OD600约为10；用高压匀浆机进行破胞，压力设为60 ～ 70 MPa，进行3个循环的破碎；将破碎后的混合液在4 ℃、10 000g条件下离心30 min，上清液使用0.22 µm的滤膜进行超滤；往镍离子层析柱中加入3倍柱体积的破胞缓冲液；然后加入上一步得到的破胞液；再用破胞缓冲液进行清洗，直到280 nm的吸收峰稳定；加入洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。

为提高目的蛋白浓度以及更换为蛋白保存缓冲液，使用孔径为30 kDa的超滤管对洗脱样本进行超滤，方法为4 ℃、5 000 r/min离心30 min，弃下层液体后加入适量蛋白保存缓冲液，重复上述步骤，直至咪唑浓度低于0.1 mmol/L。使用Bradford 试剂盒对浓缩后的蛋白样品进行定量，再加入加入等体积的甘油、1 mmol/L二硫糠醇（DTT）、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），混匀后分装，置于-80℃保存。

1.2.8 pAgos的可编码核酸酶活性测试

反应体系如下：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），0.2 mol/L NaCl，5 mmol/L MnCl2，0.5 µmol/L pAgos，0.5 µmol/L向导核酸，0.5 µmol/L靶标核酸，加入去离子水补充至总体积20 µL。首先将除了靶标核酸以外的组分混匀，在50 ℃条件下孵育10 min；加入靶标核酸后，将各个pAgos 反应液分别置于相应的温度下反应1 h，其中TtrAgo、TeAgo、MhAgo和DeAgo的温度分别为90、90、60和50 ℃；反应结束后加入等体积的2× SSCP去离子甲酰胺凝胶上样缓冲液，95 ℃变性5 min；取10 µL样本进行尿素-PAGE，在1 × TBE缓冲液、150 V条件下电泳1 h；将凝胶转移至蓝光切胶仪观察结果。

2 结果与讨论

2.1 pAgos的筛选与序列分析

NCBI的比对结果显示TtrAgo（NCBI序列号：WP_055429304.1）和TeAgo（NCBI序列号：WP_050002102.1）与PfAgo 的同源性分别为54.46%和33.02%，MhAgo（NCBI 序列号：WP_072865986.1）与MpAgo 的同源性为65.41%，DeAgo（NCBI 序列号：WP_052698403.1）与KmAgo 的同源性为49.8%。由于经文献报道的活性Agos在催化四联体（DEDX，X可以为D、H或N）位置高度保守，因此本研究分析了4个候选蛋白和已报道的活性pAgos的氨基酸序列，并以此构建了系统发育树。结果显示四个候选pAgos均具有催化四联体（图1A），分别为TtrAgo（D538、E576、D608、H725）、TeAgo（D529、E570、D602、H728）、MhAgo（D445、E481、D515、N623）及DeAgo（D529、E564、D598、D715）。在系统发育树中，各个候选蛋白与对应的参考蛋白均处于相邻分支（图1B），表明其亲缘关系较近。

图1 候选pAgos的序列分析Figure 1 The sequence analysis of pAgos (A: Results of sequence alignments; B: The phylogenetic tree)

2.2 pAgos在大肠杆菌系统中的可溶表达

为了分析pAgos 的表达对宿主细胞生长速率的影响，本研究记录了各个菌株的生长曲线（图2）。与对照组（含有pET28a空质粒）相比，TtrAgo、TeAgo和MhAgo的表达对细胞的生长无明显影响，而含有DeAgo 质粒的菌株最终的OD600仅为6 ～ 7 左右，我们推测这可能是由于表达的DeAgo 在大肠杆菌胞内环境下也具有核酸酶活性，因此对细胞产生了一定毒性所导致的。而TtrAgo、TeAgo 和MhAgo 的工作温度较高，在胞内的核酸酶活性不明显，因此对细胞的生长影响不大。

图2 生长曲线Figure 2 The growth curves

对表达了pAgos蛋白的菌液进行SDS-PAGE验证，结果显示TtrAgo（88.6 kDa）、TeAgo（89.3 kDa）、MhAgo（77.9 kDa）以及DeAgo（86 kDa）在对应的理论分子量位置均有明显的可溶表达（图3）。其中TtrAgo和DeAgo的可溶部分含量与包涵体部分相当，而TeAgo和MhAgo则主要以包涵体形式存在，这可能与pAgos的密码子、氨基酸序列以及蛋白的结构与功能有关。

图3 候选pAgos的表达结果Figure 3 The expression of pAgos

2.3 pAgos的纯化

对亲和层析后的洗脱样本进行SDS-PAGE分析，以确定是否含有目标蛋白以及目标蛋白纯度。结果显示所有候选蛋白均成功纯化（图4）。其中TeAgo的回收率低于其余3个pAgos，主要原因是其组氨酸标签与镍柱的结合强度较低，这可能是由于TeAgo的折叠导致组氨酸标签未暴露在蛋白表面导致的。总的来说，利用大肠杆菌表达系统及亲和层析可有效获得高纯度的pAgos蛋白。

图4 候选pAgos的纯化结果Figure 4 Purification of pAgos

2.4 候选pAgos的可编码核酸酶活性

本研究测试了4 个pAgos 在4 种向导核酸，即5’末端磷酸基团或羟基修饰的ssDNA 或RNA 介导下，对DNA或RNA靶标的切割效率。

当以DNA为靶标核酸时，4个pAgos均具有可编码核酸酶活性（图5）。其中TeAgo和TtrAgo可在DNA介导下高效切割DNA底物，且5’末端羟基或磷酸基团修饰的向导DNA对应的切割产物大小不一致，表明切割位点不同；MhAgo可在4种向导核酸作用下切割DNA，但效率均不高；DeAgo也能以DNA为向导核酸，但催化效率较低。除此之外，MhAgo与DeAgo的切割产物有多个条带，表明此时存在多个切割位点。

图5 4个pAgos的可编码DNA内切酶活性测试结果（AD分别为TtrAgos、TeAgo、MhAgo和DeAgo对DNA的切割结果；N表示未加入向导核酸的阴性对照，PD表示磷酸修饰的DNA，OHD为羟基修饰的DNA，PR为磷酸修饰的RNA，OHR为羟基修饰的RNA，靶标为FAM-tDNA）Figure 5 The programmable DNA endonuclease of four pAgos (A-D: The results of TtrAgos, TeAgo, MhAgo and DeAgo, respectively; N represented negative control, PD represented P-gDNA, OHD represented OH-gDNA, PR represented P-gRNA, OHR represented OH-gRNA, FAM-tDNA was used as target)

当以RNA为靶标核酸时，4个pAgos也展现出可编码的RNA切割活性（图6）。其中TeAgo和TtrAgo的活性最佳，在DNA向导的作用下可将RNA底物切割完全，不过此时的切割位点也受向导5末端的修饰基团影响；MhAgo 的结果与DNA靶标的类似，虽然在向导核酸的类型上具有全能性，但催化效率均不佳；DeAgo 则仅能使用羟基修饰的DNA作为向导，但活性较弱。

图6 4个pAgos的可编码DNA内切酶活性测试结果（AD：分别为TtrAgos、TeAgo、MhAgo和DeAgo对DNA的切割结果；N表示未加入向导核酸的阴性对照，PD表示磷酸修饰的DNA，OHD为羟基修饰的DNA，PR为磷酸修饰的RNA，OHR为羟基修饰的RNA，靶标为FAM-tDNA）Figure 6 The programmable RNA endonuclease of four pAgos (A-D: The results of TtrAgos, TeAgo, MhAgo and DeAgo, respectively; N represented negative control, PD represented P-gDNA, OHD represented OH-gDNA, PR represented P-gRNA, OHR represented OH-gRNA, FAM-tRNA was used as target)

3 结语

本研究首先通过序列比对，获得了与靶序列具有高同源性的候选pAgos氨基酸序列；其次利用大肠杆菌系统实现了候选pAgos的可溶表达，并采取亲和层析对目的蛋白进行纯化；最后建立了可编码核酸切割活性的测定方法，并以此测试了TtrAgo、TeAgo、MhAgo以及DeAgo的核酸酶活性。本研究不仅深化了对Ago的理解，且对于后继Ago核酸酶的研究工作也具有借鉴和参考价值。