HPLC对槟榔卤水原料饴糖中葡萄糖和麦芽糖的测定

陈升，刘朝来 ，龚卓，罗秋鹏，尹兴笋，周春

1.湖南伍子醉实业集团有限公司（湘潭 411228）；2.常德市自来水有限责任公司（常德 415001）

饴糖，性温、味甘，为药食同源之品，应用较广泛，具有非常重要的研究价值[1]。在我国早期饴糖的生产主要是人们利用发了芽的小麦、大麦或其他谷物，经发酵、蒸煮、熬制而成[2]，现在工艺主要是用酶法生产饴糖[3]。饴糖有补中缓急的功效，可以缓解腹中冷痛、食少呕吐的症状。饴糖和石灰粉是食用槟榔卤水[4]体系中最重要的组成部分，能直接赋予食用槟榔卤水最基础的组织结构及特殊口感[5]。其在食用槟榔卤水中的主要起到调味和中和石灰降低其碱性，减少烧口现象使其适口性变好，能保护咀嚼者口腔黏膜，其中与石灰发生反应的主要为还原糖，而饴糖中的还原糖基本是葡萄糖和麦芽糖，因此控制好葡萄糖和麦芽糖的比例能对槟榔卤水改良技术提供支持[6]。

国内检测葡萄糖和麦芽糖的方法有多种，主要分三大类，分别是光谱法、色谱法和滴定法。其中，光谱法和滴定法都是将还原糖转化为葡萄糖作为最终产物来测定含量的，过去常采用的色谱法是气相色谱法和薄层色谱法，气相色谱法中由于糖本身没有足够的挥发性，需将其转化为挥发性衍生物进行分析，制备过程操作繁琐，耗时长，易产生多种衍生物的异构体[7]。薄层色谱法的优点是操作快捷有效、无需衍生化处理，但多种单糖的分离效果差，微量成分显色不明显而且重现性不好，适合简单样品的定性分析而不能满足复杂的样品的定性定量。而液相色谱法则可直接对葡萄糖和麦芽糖进行定性定量分析[8-9]。其中，GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》[10]和GB/T 20883—2017《实验室质量控制规范食品理化检测》[11]都对糖类含量分析提供液相色谱分析的方法。

试验采用液相色谱仪法对同时测定饴糖样品中葡萄糖和麦芽糖进行研究，改进色谱分离条件，以提高检测灵敏度并延长色谱柱的使用寿命。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪（配示差折光检测器，美国Agilent公司）；ME-204分析天平、MS105DU半微量天平（梅特勒仪器有限公司）；超纯水机（湖南中沃水务环保可以有限公司）；16D033超声波清洗机（宁波新芝科技有限公司）。

葡萄糖标准物质（纯度≥99.9%，北京坛墨质检有限公司）；麦芽糖标准物质（纯度≥94.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈（色谱纯，TEDIA）；氨水（色谱纯，上海安谱科技有限公司）；超纯水为实验室自制。

1.2 色谱条件

色谱柱Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%氨水（体积比），流动相A与B按75∶25（V/V）预混合（约pH 9.5）后经0.45 μm有机系滤膜过滤。流速0.5 mL/min；柱温60 ℃；检测器温度40 ℃；进样量5 μL；检测器RID（示差折光检测器）。

1.3 标准储备液的配制

用半微量天平精确称取0.200 20 g葡萄糖标准物质，溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制成2.00 mg/L的葡萄糖标准储备液，储存于4 ℃冰箱中；用半微量天平精确称取0.211 64 g麦芽糖标准物质，溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制成4.00 mg/L的麦芽糖标准储备液，储存于4 ℃冰箱中。

将葡萄糖标准储备液用超纯水逐级稀释成质量浓度为2.00，1.50，1.00，0.50和0.25 mg/mL的标准使用液；将麦芽糖标准储备液用超纯水逐级稀释成质量浓度为4.00，3.00，2.00，1.00和0.50 mg/mL的标准使用液。

1.4 样品的处理方法

准确称取0.5 g（精确至0.000 1 g）饴糖，溶解后定容至100 mL容量瓶中，混匀，取2 mL经0.45 μm水系滤膜过滤后上机检测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

试验初期分离柱选择的是Hypersil NH2糖分析柱[12]，以乙腈-水75∶25（V/V）作为流动相。虽然也能得到较好的分离度和线性关系，但由于饴糖呈弱酸性，酸性物质的存在意味着质子的存在，会使略带负电荷的氨基官能团质子化，因此导致致使用一段时间后柱效下降较快，使用寿命短。

在选择Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）分离柱后此现象有所改观，但没过段时间仍需对分离柱进行清洗或再生，对流动相的pH进行调节，将流动相改为乙腈-0.1%氨水75∶25（V/V）后此现象大为改观。分离柱的使用寿命也大幅延长。

2.2 线性范围

按2.1中色谱条件设置高效液相色谱仪参数，注入葡萄糖和麦芽糖标准使用液，分别测定其峰面积，以标准使用液质量浓度X（mg/L）为横坐标、相应峰面积Y为纵坐标进行线性拟合，得：葡萄糖线性回归方程Y=88 327.9X+484.8，r=0.999 8；麦芽糖线性回归方程Y=87 719.3X-362.2，r=0.999 8。结果表明，葡萄糖在0.25～2.00 mg/mL、麦芽糖在0.5～4.00 mg/mL的范围内线性关系良好。饴糖葡萄糖、麦芽糖色谱分析图见图1，葡萄糖校正曲线图见图2，麦芽糖校正曲线图见图3。

图1 饴糖葡萄糖、麦芽糖色谱分析图

图2 葡萄糖校正曲线图

图3 麦芽糖校正曲线图

2.3 精密度与检出限

按2.1中色谱条件设置高效液相色谱仪参数，将质量浓度0.25 mg/L和2.00 mg/L的葡萄糖标准使用液和1个饴糖样品连续进样6针，测得葡萄糖低、中、高三水平的SRSD，见表1。

表1 葡萄糖三水平的SRSD结果

将质量浓度0.50 mg/L和4.00 mg/L的麦芽糖标准使用液和1个饴糖样品连续进样6针测得麦芽糖低、中、高三水平的RSD见表2。

表2 麦芽糖三水平的SRSD结果

由表1、表2可知，葡萄糖和麦芽糖的相对标准偏差分别为葡萄糖0.55%和0.40%，结果符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[11]附录F中实验室内变异系数≤2.0%，表明方法精密度良好。参考《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[13]，考虑到分析物中的目标物含量远超过检出限（LOQ），因此并未对该方法的检出限和定量限做过多的考虑，仅以低水平的3倍SD计算该方法检出限，得该方法葡萄糖的检出限为0.04 mg/mL；麦芽糖检出限为0.015 mg/mL，已能满足日常检测需求。

2.4 回收率

参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F中的方法对饴糖进行加标回收率的测定，准确称取15份同一个饴糖样品，每份0.500 0 g，分别对其1～15号进行编号，1～3号样品用超纯水溶解并定容至100 mL，根据葡萄糖和麦芽糖的检出限对第1组4～6号样品加标为：样品用超纯水溶解后分别加入2 mL的2.00 mg/mL葡萄糖标准溶液和1 mL的4.00 mg/mL麦芽糖标准溶液并用超纯水定容至100 mL。第2组7～9号样品的加标为：样品用超纯水溶解后分别加入25 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖标准溶液和25 mL的4.00 mg/mL的麦芽糖标准溶液并用超纯水定容至100 mL。第3组10～12号样品的加标为：样品用超纯水溶解后加入50 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖标准溶液并用超纯水定容至100 mL。第4组13～15号样品的加标为：样品用超纯水溶解后加入50 mL的4.00 mg/mL的麦芽糖标准溶液并用超纯水定容至100 mL的方法进行回收率测定试验，计算回收率及SRSD值，具体结果见表3～表5。

表3 饴糖样品的葡萄糖和麦芽糖含量结果（n=3）

由表3可知，作为底物的饴糖中葡萄糖含量和麦芽糖含量分别为17.2%和39.2%。由表4可知，在方法检出限水平、常规样品水平和方法曲线最高限度这三水平葡萄糖的加标回收率分别为99.4%，100.0%和100.2%，SRSD为0.40%。由表5可知，在方法检出限水平、常规样品水平和方法曲线最高限度这三水平麦芽糖的加标回收率分别为97.8%，98.3%和99.5%，SRSD为0.90%。所有加标结果回收率均在95%～105%之间，符合GB/T 27404—2008所要求的加标回收率的范围，因此说明该方法的准确度和重现性均为优秀。

表4 葡萄糖三水平回收率试验结果（n=3）

表5 麦芽糖三水平回收率试验结果（n=3）

2.5 样品分析

在卤水房随机抽取6桶饴糖，每桶取6个样品，将其按1.4的样品处理方法处理后注入高效液相色谱仪进行测定，结果见表6。

表6 样品含量测定结果（n=6）单位：%

3 结论

建立高效液相色谱法同时测定槟榔卤水一种重要原料——饴糖中葡萄糖和麦芽糖含量的方法，该法简便快捷，灵敏度高，重现性好，检出限低适用于食用槟榔卤水的原料——饴糖中的葡萄糖和麦芽糖含量的测定，既可为广大槟榔生产企业提供原料进厂检验的依据，也可作为控制卤水反应程度的指标，该方法对食用槟榔卤水的改良提供技术支持。