真空冷冻干燥制备花青素微胶囊及稳定性研究

许乐贝，张见，刘元法

1.白马未来食品研究院（南京 211226）；2.江南大学食品学院（无锡 214122）

花青素是以2-苯基苯并吡喃阳离子为母核，以C6—C3—C6为基本碳骨架的黄酮类物质，是一种天然的水溶性色素[1-2]。已知的花青素有20余种，自然界最基本、最常见的花青素有6种，包括矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、芍药素、矮牵牛素和锦葵花素。自然条件下游离状态的花青素极少见，花青素通常与1个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7和C3’、C4’、C5’位以糖苷键相连形成花色苷[3]。

蓝莓花青素具有显著抗氧化性能，长期食用蓝莓据称可以增强视力和大脑功能，并且可通过发挥抗炎作用减轻慢性疾病，如肥胖和糖尿病[4-5]。然而，花青素由于其本身化学结构不稳定、易在环境中降解的特性，极大限制其在食品和医疗工业中的应用。由于温度、光照、氧气、金属离子、酶和pH等多种环境因素的影响，这类化合物很容易发生降解从而失去颜色[1]。研究显示，花青素的生物利用度为0.26%～1.8%[6]。在胃中，pH 1.5～3时，其主要化学形式为黄酮阳离子，而在肠道环境中，甲醇形式占主导地位，吸收率较低[7]。因此，探索如何提高花青素的稳定性具有非常重要意义。近年来，为提高花青素的生物利用度，提出并开发纳米胶囊化、微胶囊化和蛋白质复合物等不同的新型递送系统[6,8-9]。

常见的制备花青素微胶囊的方法包括喷雾干燥法[10]和真空冷冻干燥法[11-12]。真空冷冻干燥法制备花青素微胶囊不仅能有效抑制花青素因高温、氧气等外界因素而发生变化，而且能较好保存花青素的活性及其本身的外观颜色[13]。用于微胶囊的壁材应性质稳定，不与内部的芯材发生反应，且应具有良好的乳化性、致密性和成膜性，其中多孔变性淀粉、纤维素衍生物类是具有广阔的应用前景的壁材[13-14]。在前期研究中发现，取芯壁材体积比1︰1，1︰2和1︰3，芯壁材体积比1︰1时，混合后的液体水分高，预冻时间及真空冷冻干燥时间相对延长，不利于低耗生产；芯壁材体积比1︰3时，以高浓度的魔芋粉壁材为例，芯材与壁材融合后的液体较浓稠，花青素分散不均匀，不利于制备品质均一的花青素微胶囊；芯壁材体积比1︰2时，花青素分散均匀，所制备的花青素微胶囊品质均一，且有利于低耗生产。因此，确定最佳的芯壁体积比为1︰2。

试验比较5种壁材对蓝莓花青素的包埋效果的影响，研究pH、温度、金属离子Ca2+和储藏时间对蓝莓花青素微胶囊的影响，以期为蓝莓的深加工利用和蓝莓花青素的性质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

蓝莓花青素粉末（纯度25%，西安圣青生物科技有限公司）；羟丙基淀粉、羟丙基二淀粉磷酸酯（杭州普罗星淀粉有限公司）；麦芽糊精（河南中辰生物科技有限公司）；粘米粉、魔芋粉（均购于当地大型超市）；柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钙、盐酸、无水乙醇、甲醇、乙腈、甲酸（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

真空冷冻干燥机（scientz-100FB-S，宁波新芝生物科技股份有限公司）；液相色谱仪（LC-20A，日本岛津）；恒温水浴锅（HHS-21-6，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；分析天平（BSA224S，德国赛多利斯）；pH计[FE28，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；一级纯水系统（ELIX 5+Synergy UV，美国密理博）；高速冷冻离心机（Thermo X4R pro，赛默飞）。

1.2 蓝莓花青素的包埋工艺

芯材（蓝莓花青素溶液）制备：准确称取10 g蓝莓花青素粉末（纯度25%），溶于1 500 mL一级纯水中，充分搅拌直至均匀，制得质量浓度1.67 g/L的蓝莓花青素芯材，避光阴凉处保存。

壁材制备：准确称取40，60和80 g 5种不同壁材（麦芽糊精、魔芋粉、羟丙基淀粉、羟丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉），分别溶于1 000 mL的一级纯水中，充分搅拌直至均匀，制得质量浓度40，60和80 g/L的壁材（麦芽糊精、魔芋粉、羟丙基淀粉、羟丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉）。

按照芯材与壁材体积比1︰2，吸取15 mL芯材，分别溶于30 mL的各浓度壁材中，充分搅拌直至混合均匀，倒入硅胶膜具中，在-20 ℃冰箱中预冻24 h。

真空冷冻干燥过程：预冻结束后，将各物块从硅胶模具中脱模，置于不锈钢样品盘中，进入真空冷冻干燥机设备的自动程序进行真空冷冻干燥，持续时间为48 h。真空冷冻干燥结束，收集各物块并充分碾碎，避光密封保存。

1.3 蓝莓花青素含量的液相色谱测定

准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g，固体、液体均适用）待测样品，用提取液（V无水乙醇︰V一级水︰V盐酸=2︰1︰1）定容至50 mL刻度线，混匀1 min后，超声提取30 min。超声提取后，于100 ℃沸水浴中水解1 h，取出冷却后，用提取液再次定容至50 mL，在5 000 r/min转速下离心5 min，取上清液，用0.22 μm有机相滤膜过滤，收集滤液，上机待测。

液相色谱检测条件：色谱柱大小4.6 mm×250 mm，材质5 μm C18；柱温40 ℃；进样量10 μL；流速1.00 mL/min。

1.4 蓝莓花青素包埋率的测定

花青素包埋率按式（1）计算。

式中：Ax为样品中花青素测定的实际值，mg/g，由液相色谱测定并计算所得，每个样品3组平行，取平均值；A0为样品中花青素含量的理论值，mg/g。

40 g/L的各材质壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（40×30）×100=20.83 mg/g；60 g/L的各材质壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（60×30）×100=13.89 mg/g；80 g/L的各材质壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（80×30）×100=10.42 mg/g。

1.5 蓝莓花青素微胶囊稳定性试验

1.5.1 不同壁材及浓度对花青素微胶囊的影响

测定壁材质量浓度40，60和80 g/L的麦芽糊精、魔芋粉、羟丙基淀粉、羟丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉包埋质量浓度为1.67 g/L花青素溶液芯材后的各微胶囊中花青素含量，每组3个平行，取平均值。

1.5.2 pH对花青素微胶囊的影响

向装有0.1 g的花青素微胶囊的离心管中分别加入5 mL pH 2.0，5.0和7.0的柠檬酸盐缓冲液溶液，密封后充分混匀，于室温（20 ℃）避光静置8 h，取出测定花青素含量，每组3个平行，取平均值。

1.5.3 温度对花青素微胶囊的影响

向装有0.1 g花青素微胶囊的离心管中加入5 mL pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液，密封后充分混匀，分别于4，20和60 ℃避光水浴8 h，取出测定花青素含量，每组3个平行，取平均值。

1.5.4 Ca2+对花青素微胶囊的影响

向装有0.1 g花青素微胶囊的离心管中分别加入5 mL浓度为0.1，0.5和1.0 mol/L的CaCl2溶液，密封后充分混匀，于室温（20 ℃）避光静置8 h，取出测定花青素含量，每组3个平行，取平均值。

1.5.5 储存时间对花青素微胶囊的影响

避光密封在室温储存3个月后，再次测定壁材浓度为40，60和80 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素溶液芯材后的各微胶囊中花青素含量，每组3个平行，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 壁材对蓝莓花青素包埋率的影响

5种壁材的3种不同浓度对花青素包埋率的影响如图2所示。

图2 不同壁材及壁材浓度对花青素包埋率的影响

由于麦芽糊精的DE值较低，因此常用作一种惰性包埋材料[15-16]。魔芋粉因具有良好的稳定性和成膜性，在功能性物质的微胶囊化研究中报道较多，具有一定的应用前景[17]。变性淀粉如羟丙基淀粉和羟丙基二淀粉磷酸酯在功能性物质的微胶囊化研究中鲜有报道，它们都属于食品添加剂中增稠剂的一种，具有良好的稳定性[18-19]。粘米粉是一种常见的食品原料，具有良好的稳定性和安全性，但不具有增稠性[20]。由图2可知，5种壁材的3种浓度对1.67 g/L的花青素溶液进行包埋，羟丙基二淀粉磷酸酯在各浓度下的包埋率在这5种壁材里均为最高，羟丙基二淀粉磷酸酯浓度达到60 g/L时，包埋率最高可达55.21%。这可能是由于羟丙基二淀粉磷酸酯本身作为一种增稠剂、黏结剂，遇水后膨润性高，与花青素交联紧密导致。麦芽糊精、魔芋粉在包埋评价中表现次之，粘米粉表现最差。

2.2 pH对蓝莓花青素包埋率的影响

通过选用质量浓度60 g/L、包埋率55.21%的羟丙基二淀粉磷酸酯壁材进行羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊的pH稳定性的研究。pH对羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊包埋率的影响如图3所示。

图3 不同pH对花青素包埋率的影响

结果表明，利用60 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素时，在强酸pH 2.0、弱酸pH 5.0和中性pH 7.0条件下，包埋率分别为55.17%，54.09%和51.36%，损失率分别为0.07%，2.03%和6.97%。总体来说，羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊在2.0＜pH＜7.0时具有良好的稳定性，但随着体系变中性，损失率也增大。

2.3 温度对蓝莓花青素包埋率的影响

选用质量浓度60 g/L、包埋率55.21%的羟丙基二淀粉磷酸酯壁材进行羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊的温度稳定性的研究。温度对花青素包埋率的影响如图4所示。

图4 不同温度对花青素包埋率的影响

结果表明，利用60 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素时，在4，20和60 ℃下，包埋率分别为51.61%，53.17%和47.63%，损失率分别为6.52%，3.69%和13.73%。其原因在于，温度升高时，花青素结构发生氧化降解，向无色的甲醇假碱和查尔酮转化。已有大量研究结果表明，温度对不同来源的花色苷的降解均符合一级反应动力学规律，随着加热温度的升高或时间的延长，花青素的降解速度加快，25 ℃是花青素最稳定的温度[21-22]。温度降低时，花青素结构也会发生一定程度的降解。因此，在20 ℃条件下最为稳定，适合这一微胶囊的储存。

2.4 Ca2+对蓝莓花青素包埋率的影响

选用60 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯壁材进行羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊的金属离子Ca2+稳定性的研究。Ca2+对花青素包埋率的影响如图5所示。

结果表明，利用60 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素时，Ca2+浓度0.1，0.5和1.0 mol/L时，包埋率分别为53.83%，43.69%和5.22%，损失率分别为2.49%，20.87%和90.55%。低浓度的Ca2+（＜0.1 mol/L）对花青素的稳定性没有显著影响，但随着Ca2+浓度增加，溶液由深紫色转变成深蓝色，花青素出现明显破环与损失。因此，在这一微胶囊的储存及应用环节中，应避免浓度＞0.1 mol/L的Ca2+环境。

2.5 储存时间对蓝莓花青素包埋率的影响

储藏时间（3个月）对不同壁材浓度的羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊包埋率的影响如图6所示。

图6 储藏时间对羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊包埋率的影响

结果表明，利用40，60和80 g/L的羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素时，包埋率分别为41.14%，55.21%和48.97%，经过3个月的避光密封室温储存后，包埋率分别为40.04%，54.45%和48.66%，损失率分别为2.67%，1.38%和0.63%，在各浓度下，花青素的稳定性没有发生显著变化，保存得较为完好。由此可见，羟丙基二淀粉磷酸酯是一种理想的花青素包埋剂，通过真空冷冻干燥的包埋处理可有效提高花青素稳定性。

3 结论

试验从几种较为常见的微胶囊壁材及鲜有报道的几种淀粉材料出发，比较5种壁材对蓝莓花青素包埋率的影响，筛选适合蓝莓花青素真空冷冻干燥的包埋剂。结果发现，羟丙基二淀粉磷酸酯的包埋效果显著，可能是由于其本身作为一种食品增稠剂具有良好的交联效果及稳定性所致。此外，羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊利用在食品，如软糖中，还具有协同的凝胶作用。以60 g/L羟丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素时，在强酸pH 2.0及弱酸pH 5.0条件下具有良好稳定性，在20 ℃下稳定性最佳。然而，其不耐受高浓度的Ca2+体系，Ca2+浓度为1 mol/L时，损失率达90.55%。在密封避光条件下，室温储藏3个月稳定性几乎没有发生变化。综上所述，羟丙基二淀粉磷酸酯作为一种新型蓝莓花青素的包埋剂，具有一定的应用价值。然而，羟丙基二淀粉磷酸酯-花青素微胶囊在肠胃中的代谢与人体的吸收机制需进一步进行试验验证。