基于生物信息学分析湿性年龄相关性黄斑变性的氧化应激相关基因及靶向防治中药筛选

崔高畅，Amy Yi Hsan Saik，张新慧，马玉玮，杨 早*

1.东姑阿都拉曼大学M.Kandiah 医学与健康科学学院，雪兰莪 加影 43000

2.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是全球老年人失明的主要原因之一[1]。AMD 可分为2 种亚型：非渗出性（干性，dry AMD，dAMD）和渗出性（湿性，wet AMD，wAMD）。其中，wAMD 对视力的损害程度远甚于dAMD。在由AMD 引起的严重视力损害的患者中，wAMD 占到了80%及以上[2]。wAMD 发生后患者可表现为视物不清、视物变形、视力下降、中心暗点、眼前黑影等症状。视觉的改变是由于脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）所致。CNV又称视网膜下新生血管，wAMD 发病过程中，CNV穿过Bruch 膜[3]，进入到视网膜色素上皮下或视网膜下，发生视网膜下的出血、滲出等病理性改变，对视网膜色素上皮细胞及视细胞造成损害。随着病情的发展，还可发生视网膜色素上皮出血性脱离、玻璃体积血等导致视力突然减退，严重者甚至导致失明[4]。wAMD 发病机制尚未完全阐明，可能与氧化应激有关。氧化应激可对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞造成损害，从而导致wAMD 发生发展，但少有其具体机制的相关研究。

目前，推荐的wAMD 标准治疗是基于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂的使用，这通常需要反复在玻璃体内注射，但可能导致患者对治疗依从性较差[5]。中药因其能作用于多个靶点以缓解各种症状、2 种或多种中药联合使用时的协同作用以及已被证实的安全性和有效性而闻名[6]。而筛选出预防和治疗wAMD 的中药对于临床至关重要。综上所述，本研究旨在利用生物信息学分析wAMD 的氧化应激相关基因并筛选靶向防治中药，以期为临床决策提供更多的参考。

1 材料与方法

1.1 芯片数据采集

在 NCBI-GEO（https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo/）数据库中输入“wet age-related macular degeneration”检索词，获得符合研究需求的基因表达芯片数据集GSE103060。该数据集基于GPL6480芯片分析平台，由Ehlken 等[7]于2017 年提交，GSE103060 样本包含16 个样本，本研究选取其中12 个，其中8 例CNV 样本和4 例人视网膜色素上皮细胞ARPE-19 正常样本（对照）。所有数据均可于GEO 数据库直接获取，本研究不涉及伦理问题。为了确保数据集的完整性和可比性，使用R 软件4.3.1 对以上2 组芯片数据进行背景校正、标准化和取对数的转换。并利用factoextra 和FactoMineR 包绘制聚类图、主成分分析（principal component analysis，PCA）和箱线图。

1.2 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选

利用R 程序中limma 包，以|log2FC|≥1［FC 表示差异倍数（fold change）］且P＜0.05 为筛选条件进行DEGs 分析。Pheatmap 和ggplot2 软件包分别用于绘制可视化热图和火山图，以显示重要DEGs的表达。

1.3 DEGs 的功能富集分析

为了进一步探索上述DEGs 的潜在功能，用clusterProfiler R 软件包对DEGs 进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析（筛选标准设定为P＜0.05），以探究DEGs 的生物过程（biological processes，BP）、细胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）及相关通路。并利用微生信在线网站（https://www.bioinformatics.com.cn）进行可视化。

1.4 氧化应激相关基因的获取与筛选

从GeneCard数据库（https://www.genecards.org）筛选相关性评分＞7 分的氧化应激相关基因，之后与GSE103060 数据集DEGs 取交集为wAMD 中氧化应激相关DEGs。

1.5 wAMD 中氧化应激差异基因的功能富集分析

用Metascapes（https://metascape.org/gp/index.html）对wAMD 中氧化应激相关DEGs 进行了GO与KEGG 分析（筛选标准设定为P＜0.01），以探究DEGs 的BP、CC、MF 及相关通路。并利用微生信进行可视化。

1.6 蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）网络构建和关键基因的筛选

将筛选出来的氧化应激差异基因导入String 网站（https://www.string-db.org）进行分析，获得PPI网络。利用Cytoscape 中的CentiScaPe 2.2 插件，采用3 种算法［度中心性（degree）、接近中心性（closeness）、中介中心性（betweenness）］对氧化应激差异基因筛选关键基因（各种算法中均排前10 的关键基因），之后取这些关键基因的交集，最终得到8 个关键基因。

1.7 氧化应激相关关键基因验证

利用GSE103060 作为验证数据集，验证关键基因在2 组样本中的表达水平，并绘制柱状图。

1.8 wAMD 靶向防治中药的预测

利用COREMINE Medical 在线数据库（http//:www.coremine.com/medical）整合中药与基因互作关系，筛选出药食同源的中药材作为预防wAMD 的策略。将关键基因输入数据库，按照中药中关键基因的频次≥7 来筛选出靶向防治中药。

2 结果

2.1 芯片数据质量

运用R 语言对基因表达谱数据集GSE103060进行标准化正态处理，并绘制芯片数据相对表达值均一化箱线图（图1-A）。结果显示，12 个样本的中位数基本位于1 条水平直线，聚类图（图1-B）和PCA 图（图1-C）显示CNV 组与对照组有显著差异。提示基因芯片质量良好，无异常表达，两组之间的数据具有可比性，可继续用于下一步分析研究。

图1 GSE103060 表达谱数据质量分析 (A)、聚类分析 (B) 和PCA 分析 (C)Fig.1 Quality analysis (A), cluster analysis (B) and PCA analysis (C) of GSE103060 expression profile data

2.2 DEGs 的筛选

对GSE103060 进行差异表达分析，得到1 874个DEGs，其中上调基因747 个，下调基因1 127个，DEGs 的火山图如图2-A 所示，DEGs 的热图如图2-B 所示。说明CNV 组与对照组有显著差异。

图2 wAMD 差异基因的火山图 (A) 和热图 (B)Fig.2 Volcano map (A) and heat map (B) of wAMD differential genes

2.3 DEGs 的功能富集分析

GO 分析显示，wAMD 差异基因主要富集在外部包裹结构组织（external encapsulating structure organization）、细胞外基质组织（extracellular matrix organization）、细胞外结构组织（extracellular structure organization）、调控神经突触发育（regulation of neuron projection development）、轴突发育（axon development）等生物学过程。主要定位于胶原含有的细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、内质网腔（endoplasmic reticulum lumen）、肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）、谷氨酸能突触（ glutamatergic synapse ）、基底膜（ basement membrane）等细胞成分。参与细胞外基质结构组分（extracellular matrix structural constituent）、整合素结合（ integrin binding ）、糖胺聚糖结合（glycosaminoglycan binding）、肝素结合（heparin binding）、硫化合物结合（sulfur compound binding）等分子功能。GO 富集柱状图展示了BP、CC、MF排名前10 的GO 术语（图3-A）。

图3 wAMD 表达谱差异基因的GO (A) 和KEGG (B) 分析Fig.3 GO (A) and KEGG (B) analysis of differential genes in wAMD expression profiles

KEGG 分析结果显示，wAMD 差异基因主要富集于细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）、黏附斑激酶（focal adhesion）、蛋白质消化吸收（protein digestion and absorption）、河马信号通路（Hippo signaling pathway），癌症信号通路（proteoglycans in cancer）、糖尿病并发症糖尿病并发症晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（ advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、钙信号通路（calcium signaling pathway）、近端小管碳酸氢盐回收（proximal tubule bicarbonate reclamation）、轴突导向（axon guidance）和磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，排名前10 的信号通路见图3-B。

2.4 wAMD 中氧化应激DEGs 的功能富集分析

DEGs 富集分析从GeneCards 中得到1 189 个氧化应激相关基因，将其与GSE103060 的1 874 个DEGs进行韦恩分析，得到wAMD中氧化应激DEGs共117 个（图4）。GO 分析显示，wAMD 差异基因主要富集在应对氧化应激（response to oxidative stress）、应对降低的氧气水平（response to decreased oxygen levels）、细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、应对氧气水平（response to oxygen levels）、应对低氧症（response to hypoxia）等生物学过程，主要定位在氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、信号受体激活活性（signaling receptor activator activity）、信号受体调节活性（signaling receptor regulator activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）、蛋白质同源二聚体化活性（protein homodimerization activity）等细胞成分。参与囊泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、胞浆囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、细胞外基质（extracellular matrix）、外部包围结构（external encapsulating structure）等分子功能。GO 分析柱状图展示了BP、CC、MF 排名前10 的GO 术语（图5-A）。

图4 氧化应激相关基因与wAMD 差异基因的韦恩图Fig.4 Venn diagram of oxidative stress-related genes and wAMD differential genes

KEGG 分析结果显示氧化应激相关差异基因主要富集在流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、癌症信号通路（pathways in cancer）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（ AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、Rap 信号通路（Rap signaling pathway）、活性氧物质化学诱癌（chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）等。排名前20 的信号通路见图5-B。

2.5 PPI 网络构建及功能模块分析

将117 个氧化应激差异基因导入String 数据库构建PPI 网络，预测差异表达基因编码的蛋白质之间的相互作用。通过Cytoscape 创建了一个共有108个节点、745 条相互作用线的PPI 网络图（图6）。

图6 PPI 网络 (A) 及其优化 (B)Fig.6 PPI network (A) and its optimization (B)

2.6 关键基因筛选

基于Cytoscape 中的Centiscape2.2 插件，利用其中3 种不同的算法分别筛选出评分最高的关键基因。结果如表2 所示，3 种算法中的关键基因取交集，得到共有的8 个关键基因：白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、低氧诱导因子-1α（低氧诱导因子-1α，HIF1A）、载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、纤维连接蛋白基（fibronectin-1，FN1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor gamm，PPARG）、内皮素1（endothelin 1，EDN1）和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）。

表2 wAMD 中氧化应激相关关键基因的筛选Table 2 Screening of oxidative stress-related key genes in wAMD

2.7 氧化应激相关关键基因验证

在数据集GSE103060 中，关键基因的表达水平结果（图7）显示，在CNV 样本中IL6、HIF1A、EDN1和FN1的表达均显著高于对照组，APOE、PPARG、NGF和EGFR的表达均显著低于对照组。

图7 8 个氧化应激相关关键基因验证Fig.7 Verification of eight key genes related to oxidative stress

2.8 wAMD 防治中药的预测

利用 COREMINE Medical 在线数据库（http://www.coremine.com/medical）整合中药与基因互作关系，筛选防治wAMD 的中药。以8 个氧化应激相关的关键基因作为筛选条件，出现频次≥7的中药见表3，可作为防治wAMD 的新策略。

表3 靶向防治wAMD 的中药预测Table 3 Prediction of traditional Chinese medicine for targeted prevention and treatment of wAMD

3 讨论

wAMD 被认为是代谢、功能、遗传和环境因素之间复杂的多因素相互作用的结果。其中衰老、光照和吸烟等因素已被证明通过诱导氧化应激来促进wAMD 的发病机制，而氧化应激是目前被证实最直接的wAMD 致病因素。由于阳光照射和高氧浓度，视网膜的氧化应激负担高于其他组织，从而导致视网膜中氧化脂质的水平增加。许多脂质氧化产物已被证明对光感受器和RPE 细胞具有促炎和毒性[8]。这与本研究结果一致，从Top 10 的KEGG 通路中得到与氧化应激有密切相关的通路有6 个，分别是细胞外基质受体相互作用、黏附斑激酶通路、Hippo信号通路、AGE-RAGE 信号通路、钙信号通路和PI3K-Akt 信号通路。

通过对CNV 样本中的氧化应激相关差异基因筛选，得出最关键的8 个基因，分别是高表达的IL6、HIF1A、EDN1和FN1以及低表达的APOE、PPARG、NGF和EGFR。

IL-6 是与炎症相关最为典型的细胞因子。在视网膜中，小胶质细胞通过释放并与一系列细胞因子和趋化因子的相互作用来保护视网膜；然而，当长时间暴露于IL-6 等促炎细胞因子时，小胶质细胞活性会发生退行性变化，并促进循环免疫细胞的募集。这些活性促进内皮细胞迁移和小管形成，从而影响局部血管生成反应的幅度。Čolak 等[9]发现wAMD患者的IL-6 水平相比早期的AMD 值更高一点，而这主要是由于慢性低度炎症而导致，这与本研究结果一致。因此，认为降低慢性低度炎症是控制AMD的关键之一。

HIF1A 是一种转录因子，能够在缺氧条件下激活多种基因的表达，包括VEGF，从而促进血管生成[10]。氧化应激可以影响HIF1α 的表达和功能，从而影响血管生成的平衡。在wAMD 组织样本中，HIF1A的表达水平显著上调，可能加剧wAMD 的发展。

EDN1 在血管功能中是重要的调节因子，决定血管中的血流，可能参与血管生成。EDN-1 的产生和释放可以受到氧化应激的影响。研究表明，氧源性自由基可以增加培养内皮细胞中内皮素-1 的合成，但氧化应激诱导EDN1 含量升高的机制尚不清楚。Choręziak 等[11]在一项早产儿视网膜病变相关研究中，证明EDN1 与视网膜病变有关，这与本研究结果一致，相比对照组，CNV 组的EDN1表达显著升高，表明EDN-1 可能是防治wAMD 的重要潜在靶点。

FN1[12]是由纤维母细胞、内皮细胞、巨噬细胞和肝细胞等合成和分泌的一种糖蛋白，存于体液、细胞表面、结缔组织和基底膜中，也分布于眼组织细胞，具有促进组织细胞生长的作用，FN 已用于一些眼病的治疗，特别是用于促进角膜上皮修复，取得了较好效果。但目前鲜有FN1 关于wAMD 的报导。在本研究结果中，与对照组相比，FN1在CNV组的表达显著上升，这可能与眼部自我修复的功能激活有关。

APOE 可以影响血管生成和血管完整性，从而影响视网膜的血液供应和氧气输送。尽管APOE 是与阿尔茨海默病密切相关的基因，但APOE 可以影响β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的清除和纤维化，从而导致Aβ 在视网膜中的沉积和损伤。并在RPE 细胞中高度表达[13]。一项研究表明，缺乏APOE 的小鼠表现出脂质和糖代谢异常，并发展出布鲁赫膜增厚以及基底RPE 细胞和布鲁赫膜中脂质沉积。Rasmussen 等[14]研究也发现，APOE 结构的变异可能提高AMD 的风险。由此证明，APOE 也是wAMD 潜在的关键基因。

PPARG 是一类脂质激活转录因子，参与脂质代谢和炎症过程。在各种致盲疾病中的代谢、血管生成、纤维化、炎症和氧化应激等多种生理过程的控制中发挥重要作用[2]。而在本研究结果中，PPARG在CNV 组样本中显著下调。提高PPARG的表达水平对防治wAMD 有重要意义。

NGF 是一种促进交感神经和外周胆碱能神经生长以及神经感觉通路发育和生长的营养因子。研究表明在动物模型中[15]，眼内给药NGF 可抑制视网膜神经节细胞变性从而改善AMD 患者的视力。

EGFR 是一种膜酪氨酸激酶受体，能够调节细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等过程，Chen 等[16]报道氧化应激可破坏EGFR/Akt 信号通路，从而抑制ARPE-19 细胞的存活。这一发现提示EGFR/Akt 信号通路可能是预防RPE 细胞氧化损伤的重要靶点。在CNV 组样本中，EGFR的表达水平显著下调，可能导致血管生成和RPE 细胞损伤，从而加剧wAMD的进展。

AMD 属于中医学“视瞻昏渺”的范畴，在《证治准绳》中首次提出这一病名，并说明了其眼外观无异常，但出现视物昏朦、视如曲线的症状[17]。一项临床探究统计得出wAMD 的病位证素[18]特征主要为肝、肾、脾，病性主要为阴虚、痰湿、血瘀、气虚，常见证型有肝肾阴虚、脾虚湿困、痰瘀互结、阴虚火旺、脾虚气弱。其中肝肾阴虚、精亏血少为主要的病因病机，治疗应以补益肝肾、滋阴明目为主。本研究结果与此不谋而同，预测到补益类中药有人参、人参叶、人参花、枸杞子、白果、黄芪、杜仲、郁金。这些中药具有滋补、提高免疫力、改善体质的作用，可用于防治wAMD。而血行类中药丹参、川芎和红花有助于促进血液循环，可以用于一些与眼部血液供应不足相关的问题。清热解毒类中药大黄、黄连和黄芩通常用于清热解毒，可以在一些眼部感染或炎症的治疗中有一定的作用。葛花、金银花、红花和银杏叶富含抗氧化剂，有助于保护眼睛健康，可以用于一些与眼睛老化或疲劳相关的问题。因此，推荐使用以上中药来防治wAMD，这对中医指导下的用药提供了新的方向。

4 结论

本研究基于基因芯片，通过对wAMD 芯片的挖掘和生物信息分析，差异基因主要富集于氧化应激的相关通路（细胞外基质受体相互作用、黏附斑激酶通路、Hippo 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、钙信号通路和PI3K-Akt 信号通路）。发现wAMD 的氧化应激主要是由IL6、EGFR、HIF1A、APOE、FN1、PPARG、EDN1、NGF引起的。而防治wAMD 氧化应激的首选中药为人参、黄芪、枸杞子、丹参、银杏叶等26 种。这将对理解和探索wAMD 的中医药防治有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突